体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验

【摘要】探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。［方法］体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。［结果］16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合，组织观察显示以软骨细胞修复为主，软骨下骨形成，潮线基本恢复；阴性对照组缺损区主要由纤维组织修复，部分由透明软骨修复，组织观察显示以纤维细胞修复为主，混有部分软骨细胞；空白对照组完全由纤维组织修复。［结论］MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs－PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。

关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，以往临床使用的治疗方法均难以达到理想的要求。组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。本实验研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MSCs）为种子细胞，经软骨细胞诱导生长因子的诱导培养后，与聚羟基乙酸（polyglycolicacid，PLA）－聚乳酸（polylacticacid，PGA）共聚物(PLGA)支架材料复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬膝关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的软骨细胞－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。期望能够找到软骨组织工程理想的种子细胞和支架材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1种子细胞10～12个月龄健康比格犬，无菌穿刺抽取髂骨骨髓7～8ml，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。

1.1.2支架材料将PLGA支架(购自山东医疗器械研究所)剪成1.0cm×1.0cm×0.2cm大小的方块，放入12孔板内，然后经紫外线照射30min消毒，备用。

1.1.3受体动物及分组10～12个月龄健康比格犬10只（购自山东大学动物实验中心），体重在8～10kg。在每只犬的双侧膝关节分别制造3个骨软骨缺损区，随机分为3组。A组：实验组关节软骨缺损内深层植入MSCs复合PLGA支架材料，浅层植入经过诱导培养的软骨细胞复合PLGA支架材料，紧密压配；B组：阴性对照组，缺损内仅植入MSCs复合PLGA支架材料；C组：阳性对照组，缺损内不植入任何材料。

1.1.4主要试剂一抗：兔抗人Ⅱ型胶原抗体，二抗:山羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒，以上均购自武汉博士德公司。

1.2方法

1.2.1MSCs向软骨细胞定向分化P1传代细胞培养至细胞铺满瓶底时，消化后调整细胞浓度，加入含TGFβ110ng/ml、10％胎牛血清的低糖DMEM溶液诱导培养。

1.2.2诱导MSCs的鉴定（1）糖胺聚糖（GAG）检测（表1）。取传代培养第二代MSCs（P2），实验组加入TGFβ1诱导培养，对照组用常规培养液培养，待细胞长满全层时，胰酶消化，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板每孔200μl，继续加入含不同的培养液每孔200μl，每组5孔，培养第3d换液1次，第7d（诱导培养后第15d）时，取细胞培养上清液，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测细胞培养上清液中GAG含量；（2）Ⅱ型胶原免疫组化按试剂盒说明书进行操作，Ⅱ型胶原阳性的细胞，胞浆着色呈黄色或棕黄色（表2）。表1细胞因子对MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的检测表2Ⅱ型胶原免疫组化阳性细胞数（个/视野）

1.2.3细胞－支架复合体的构建及其体外培养将上述2种细胞悬液调整浓度后，滴加到PLGA支架上，37℃、5％CO2孵箱培养。继续各用原培养液进行培养7～8d，备扫描电镜检查和动物实验。

1.2.4复合体移植10～12个月龄健康比格犬10只，静脉麻醉成功后，术区准备完毕后，取膝关节内侧切口，显露膝关节，在膝关节股骨滑车处，用手摇钻制作一个直径为5mm的圆柱形软骨缺损区，深达软骨下骨，平均深为5mm。按照分组情况，A组：软骨缺损处先在深层植入未诱导分化组的MSCs－PLGA复合体，再在浅层植入诱导分化组的软骨细胞－PLGA复合体，紧密压配；B组：缺损处全层植入未诱导分化组的MSCs－PLGA复合体；C组：空白对照，只造成缺损不植入任何材料。严密缝合关节囊。术后分笼饲养，自由活动。

1.2.5大体观察分别于术后12、16周取材，观察缺损区软骨生长情况。

1.2.6组织学观察

2结果

2.1细胞形态学改变

倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后1～3d可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3d后出现细胞集落，7～8d广泛集落形成。12～14d细胞形成单层。传代细胞贴壁快，7～8d形成单层，细胞核大，胞浆内颗粒多。加入细胞因子后，细胞生长明显加快，体积增大，胞体变圆，呈漩涡状生长；

2.2实验组

MTT吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ型胶原分泌均明显高于对照组。Ⅱ型胶原免疫组化阳性的MSCs胞浆染色为黄色或棕黄色(图1、2)。

2.3电镜观察

扫描电镜显示PLGA支架呈不规则多孔状，孔径控制在200～300μm，孔径率85%，孔壁厚度较均匀,为20～40μm。复合材料显示MSCs细胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用(图3)，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。

2.4动物实验结果

大体观察。术后12周：A组新生组织表面平整、光滑，与周围软骨界线模糊，端面显示软骨厚度与正常软骨相近；B组修复高度较周围软骨水平相近，但软骨层厚度比A组明显偏薄，无光泽，与周围软骨界线尚清楚；C组部分接近正常修复高度，修复组织呈黄色，局部凹陷。术后16周，A组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异(图4)；B组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差(图4)；C组缺损处修复组织低凹新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。

组织学观察。术后12周：A组缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周时淡，软骨下骨丰富。B组边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。C组表面为纤维组织，细胞成分较少。术后16周，A组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好(图5)。B组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复(图6)。C组缺损区内主要为纤维组织(图7)。

2.5统计学分析

采用SPSS10.0统计软件包分析，数值以±s表示，以P＜0.05表示差异有显著性意义。表3关节软骨缺损的组织学评分标准表4各组软骨修复组织学评分结果各时间段A组与B组、C组比较均有显著性差异，*P＜0.05。

3讨论

有研究认为对于微环境尚未受到严重破坏的组织修复或再生治疗，不需要进行体外诱导即可用干细胞直接移植修复，而对于缺损或微环境严重受损的组织修复或再生治疗，则需要对干细胞进行定向诱导后移植［1］。作者的实验结果表明，在体外对MSCs进行诱导培养，(1)可以使细胞扩增；(2)可以向软骨细胞定向分化。在体外构建成熟的组织工程化软骨，是在模拟体内微环境的条件，探索和研究软骨种子细胞在支架内黏附、增殖及种子细胞与支架材料的相容性即软骨形成的条件、机制的问题。作者把细胞－PLGA支架复合体在体外培养1周后，塑成圆柱状，采用马赛克移植方法植入缺损部位，底部为MSCs?PLGA支架复合体，表层部分为诱导培养的MSCs?PLGA支架复合体。在体内微环境的作用下，迅速生成软骨组织。在12周时，软骨组织已充满了整个缺损区，随后深层软骨组织逐渐被软骨下骨替代。16周时软骨细胞出现分层排列，与周围正常组织无明显差别。在制造骨软骨缺损模型的时候，损伤区会释放生物活性因子，包括TGF?β、IGF?1和BMP［2］。早期复合组织植入缺损部位后，在这些细胞因子的作用下，经诱导的MSCs细胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表层的复合体在关节内滑液细胞因子和周围软骨组织微环境的作用下形成早期软骨组织。而深部的复合体被来自于损伤区的血管组织侵入，机体的MSCs细胞和诱导植入的MSCs细胞，在局部微环境的作用下，形成骨组织－软骨下骨，从而完成骨软骨缺损组织的修复。这种修复的特点是软骨与软骨下骨形成坚固的自然连接，软骨下骨与软骨同时获得修复。但是作者某些切片中观察到2种复合体之间有裂隙、整合差，但深部复合体与软骨下骨的结合均良好。

尽管很多专家学者在体内、体外均成功构建出骨软骨复合组织［3～7］,但是存在以下问题:(1)无论在体外或体内,构建组织的骨、软骨界面结合欠佳；（２）植入软骨与周围宿主软骨组织整合欠佳；(3)形成的软骨组织质量缺陷:透明软骨比例少,缺乏正常关节软骨的分层结构,缺乏表浅的扁平细胞层和潮标等；（４）更为重要的是,以上构建的骨软骨复合组织只是短期观察有证据初步表明在形态学、生化成分等方面具有骨软骨组织结构,其生理功能、机械性能、能否长期持续存在等尚待进一步研究证实。为了改善骨软骨复合组织的结构和界面形成情况,设计一体化、呈梯度变化的双层支架材料将更为有利。Sherwood等［8］应用TheriForm三维打印方法研制出一种新型的骨软骨三维支架,在骨、软骨端配件交界区组成成分含量、气孔率等方面形成梯度变化,这样可以避免支架在体外培养和体内植入时发生界面分层而有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面。

本实验结果证实：MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞。取材方便，体外培养性能稳定，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞。TGF?β1在促进MSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有显著的作用。PLGA支架是理想的软骨组织工程支架材料，具有良好的孔隙率和组织相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs－PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。

图1对照组MSCs免疫组化结果阴性，胞浆内未见到棕褐色颗粒图2实验组MSCs免疫组化结果呈阳性，胞浆内见有棕黄色颗粒图3细胞在支架材料上黏附、增殖，形成细胞团，借伪足锚固于支架上图4A组（黄箭头）修复软骨厚度较B组（绿箭头）厚，与周围组织边界不清，需仔细辨认（4个月后）图5A组缺损区软骨下骨结合紧密，潮线形成，与周围软骨组织融合好（4个月后×20）图6B组缺损由纤维组织修复，细胞排列规律，与软骨下骨结合尚可，局部有裂隙（4个月×10）图7C组缺损部分纤维组织，排列杂乱，见分泌基质。