骨髓间质干细胞与Ⅱ型胶原修饰的

【摘要】优化骨髓间质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)体外分离培养技术，改良生物材料聚乙醇酸-乳酸共聚物(polylactide?coglycolide，PLGA)的细胞黏附性，观察BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PLGA的黏附性。［方法］密度梯度离心法分离BMSCs，流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测，相差显微镜观察细胞形态。相分离法制做PLGA，Ⅱ型胶原进行表面修饰，取第三代干细胞与PLGA附和，扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。［结果］BMSCs可在体外分离扩增，表达CD29、CD44和CD106，不表达CD34和CD45，细胞活力为88.96％，G0?G1细胞占90.32％。细胞形态为长梭形，Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA平均孔径为100μm，与BMSCs有较好的黏附性。［结论］BMSCs可在体外长期、稳定培养，是理想的组织工程种子细胞。Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA与干细胞有较好的黏附性，可用来做组织工程生物材料。

组织工程修复受损组织的基本方法就是将种子细胞种植于生物支架材料上，经体外培养一定时间后再植入体内达到修复和重建受损组织的目的，所以细胞与生物支架材料的黏附性就成了构建组织工程化组织和器官的关键问题之一。本研究将体外提纯，扩增的BMSCs种植到经Ⅱ型胶原修饰的PLGA材料上联合培养，扫描电镜观察其黏附情况，观察Ⅱ型胶原修饰的PLGA材料的细胞亲和性，探索以BMSC为种子细胞，以Ⅱ型胶原修饰的PLGA为生物支架材料构建组织工程的可行性，为临床组织工程的应用研究提供理论和实验数据。

1材料和方法

1.1材料和仪器

SD大鼠(广东省动物中心)；PLGA(济南迈康公司，分子量10万单位)；胎牛血清(FBS)、淋巴细胞分离液(天津TBD公司)；DMEM(Dulbecdominimumessentialmedium)干粉培养基、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原(Sigma公司)；流式细胞仪FACSAria(美国BD公司)；CD29FITC、CD44FITC、CD106PE、CD34PE和CD45FITC(Ancell公司)；PI(Sigma公司)；扫描电镜(日立公司，日本)。

1.2PLGA的制备合成及扫描电镜观察

70∶25的PLGA溶解于二氧六环匀速搅拌3h，溶液浇铸平皿上，-20℃放置过夜，放入质量比为30∶70的酒精溶液中萃取8h，连续3次，将结块样品放入真空机冷冻干燥。制备成10mm×10mm×5mm大小的样品，将上述得到的样品10个放入含5mgⅡ型胶原的5mlPBS溶液中振荡混合1h，入真空机冷冻干燥。质量法测定其孔隙率［1］。取小块PLGA材料，固定于2％的戊二醛24h，0.1mol/LPBS(pH7.2)洗3次，不同梯度酒精逐级干燥，样品镀金，电镜扫描。

1.3BMSCs的体外培养

1个月龄SD大鼠，脱颈处死，取双侧股骨，剔净软组织，75％酒精浸泡消毒5min，PBS洗2次，剪断股骨一端后，用带5号针头的注射器将体积分数为10％胎牛血清的DMEM(含100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素和20U／ml肝素)冲洗股骨骨髓腔，取混合骨髓液4ml缓慢注入事先准备好的含6ml的淋巴细胞分离液的离心管内，800g离心20min，取出中间层的单核细胞接种于25cm2培养瓶，37℃、5％CO2培养箱静置培养。5d后首次换液，以后每隔3d换液，长满后传代，取P3细胞进行实验。

1.4BMSCs的形态学观察

原代及传代培养的细胞，用倒置相差显微镜逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征。

1.5BMSCs的鉴定

FACS检测BMSCs的表面抗原，将对数生长期的P４细胞消化分离(37℃，3～5min)，收集细胞制成1×106个细胞／ml的细胞悬液。加入500μl适当稀释度的FITC标记抗人CD29、CD44、CD45单克隆抗体，PE标记抗人CD34和CD106单克隆抗体，反应30min后检测。

1.6BMSCs的生长曲线，细胞周期及活力的检测

取P1、P3、P5的细胞以104个细胞／ml接种于24孔培养板内，每天同一时间消化3孔计数，连续计数8d绘制生长曲线。收集P3细胞，制成1×106个细胞／ml的细胞悬液，FACS对BMSCs的细胞活力和细胞周期进行检测。

1.7BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PLGA复合

取P3细胞，调整浓度为106个细胞／ml。已制作好的支架材料经60Co消毒后用无菌DMEM培养基反复冲洗，培养箱内晾干，把PLGA放于24孔板的孔底，滴加100μl的细胞悬液，培养1h后翻转，再在另一面滴加100μl细胞悬液，培养1h后加培养基淹没整个基质材料，每周换液2次，体外培养2周，分别在复合后1、7、14d取材，作扫描电镜观察。

2结果

2.1Ⅱ型胶原修饰的PLGA扫描电镜观察

合成的复合PLGA为多孔的三维立体结构，电镜扫描可见：PLGA内部形成大小不一的大孔和互连的小孔，彼此相互交通，支架四处均可见白色的微小Ⅱ型胶原颗粒(图1)。应用质量法测得的孔隙率为90％，孔径在50～200μm之间，平均孔径为100μm。

2.2BMSCs形态学观察

原代细胞的观察：刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液中，8～10h开始逐渐沉降贴壁，48h少数贴壁细胞呈成纤维细胞样外形，3～5d贴壁细胞开始增殖呈克隆生长，5～7d后部分细胞成细胞团簇，细胞多为梭形，胞核明显为卵圆形或圆形。可见1～3个核仁，胞质丰富、胞浆清晰。原代培养12d可长满瓶底。培养液中的渣滓随换液被逐渐清除。

传代细胞的观察：传代后的细胞增殖迅速，2～4h开始贴壁，6～8h贴壁基本完全，于3d细胞数量开始明显增多，5～6d可长满瓶底，融合成片状，细胞排列更加整齐，细胞均匀分布，生长较均匀一致，杂细胞已较少(图2)。传6代以上的细胞可见胞体增大，胞质稀薄，细胞的增殖速度较以前已有所减慢。传至9～10代细胞已出现衰老死亡现象。

2.3BMSCs鉴定

流式细胞表面抗原标志，CD29表达为97.98％，CD106表达为63.38％，CD44表达为52.61％，CD34表达为0.66％，CD45表达为0.57％(图3a、b、c)。

2.4BMSCs生长曲线，细胞周期及活力的检测

2.4.1生长曲线P1、P3、P5BMSCs在接种的0～1d细胞处于潜伏期，2d细胞开始增殖，3d进入快速生长期，从5d开始进入平台期(图4)。

2.4.2细胞周期及活力FACS检测P3细胞的活力为88.96％(图5)，细胞周期中G0?G1：90.32％，G2-M：8.03，S：1.50％，G2／G：0.15(图6)。

2.5BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PLGA复合及增殖

扫描电镜观察发现BMSCs复合到Ⅱ型胶原修饰的PLGA支架后2d，即在PLGA基质材料上黏附和伸展，呈成纤维样细胞。7d时细胞数量已明显增多，与支架材料结合较紧密(图7)。14d时，细胞增殖，相互间融合，并有大量的细胞外基质分泌，大部分材料颗粒被覆盖(图8、9)。

3讨论

骨基质材料是骨组织工程的关键构成要素。相对于不可降解的骨基质材料(如HA)，可降解的生物材料在植入体内后能最终被再生组织所取代，勿需2次手术取出，成为临床上较为常用的骨替代品。PLGA是乳酸和乙醇酸聚合而成，是目前国内外常用的支架材料［2］，其结构及亲水、疏水性可以通过两者的不同比例进行调节，从而决定支架材料在体内的降解速率［3］，它在体内降解的最终代谢产物为CO2和H2O，不在体内蓄积，几乎没有毒副作用，已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于缝线、暂时性支架和药物缓释载体［4］。胶原是一种软、硬组织工程经常使用的天然材料，它可以增强细胞的黏附效果、避免反应物反应、增加生物的安全性，HosokawaR［5］等人已把胶原用来作为bFGF、NGF、IGF?α等的载体，并取得较好的结果。本实验用物理方法用Ⅱ型胶原修饰PLGA，增加它的细胞黏附性，改良其生物活性，本实验所制作的PLGA孔径在50～200μm之间，平均为100μm，完全符合YaylaogluMB［6］等人得出的结论“支架材料的孔径略大于拟植入细胞的大小”。

BMSCs是一种存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有分化成各种间叶组织的功能。近年来研究表明BMSCs体外分离培养后，在一定的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等定向分化的能力［7］，BMSCs为贴壁细胞，它表面标志并非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，BMSCs能够不断自我复制而不分化，在其增殖分化过程中表面标志不断变化。一般认为整合素家族成员CD29,黏附分子CD44,CD106等是BMSCs保持未分化状态时较为特异性的表面标志［8］，虽然BMSCs与造血细胞共同存在于骨髓中，但不表达造血系统的标志，如CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45。本实验从骨髓中分离贴壁生长的BMSCs,流式细胞仪分析第4代BMSCs强表达CD29，表达CD44和CD106，而不表达CD34、CD45，证实其为BMSCs应用单核细胞分离液从骨髓中分离贴壁生长的BMSCs是一种经济、简单、有效的分离方法。本实验中分离所得的BMSCs在低糖DMEM培养基中扩增较迅速，具有较强的增殖能力，体外培养至第8代仍保持未分化状态，为体外组织工程成骨提供了足够的准备时间。BMSCs作为骨组织工程中首选的种子细胞，具有取材方便，增殖能力、成骨能力强［9］，免疫原性弱［10，11］，基因容易导入等优点，在目前骨组织工程中应用非常普遍［12］。

细胞与基质材料的相互作用也是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的黏附是基础，细胞必须与材料发生适当的黏附，才能进行迁移、增殖和分化。实验结果表明：BMSCs接种到支架材料上后24h就已贴附、伸展。本实验通过扫描电镜观察发现：复合PLGA支架上的BMSCs在3d已牢固地附着于材料表面，分泌胞外基质，至复合后14d，BMSCs增殖明显，细胞和分泌的胞外基质已覆盖材料大部分颗粒，提示BMSCs复合于PLGA后，其黏附、增殖和分化特性未受明显影响。

综上所述，本实验采用相分离法合成PLGA，经Ⅱ型胶原修饰后其大体形态、微结构等方面都令人满意。BMSCs在体外复合PLGA后，通过形态学观察，发现BMSCs可在Ⅱ型胶原修饰的PLGA表面良好附着、伸展、增殖，分泌胞外基质，因此本文认为复合材料PLGA对细胞生长和功能表达无抑制作用，Ⅱ型胶原可明显增加生物材料的细胞黏附性，BMSCs可以在经Ⅱ型胶原修饰的PLGA表面长期增殖生长。作者将进一步深入研究材料的机械强度、理化性质、移植细胞的寿命及定向分化等问题，为下一步将要进行的体内移植应用打下基础。