人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP-HPLC测定法

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【摘要】目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸(AsymmetricDimethylarginine,ADMA)浓度的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。

方法:采用WaterssymmetryC18柱(5μm,3.90mm×150mm),以0.05mmol/L乙酸钠(pH6.8)为流动相A,甲醇为流动相B,线性梯度洗脱:14%15min,31%25min,45%5min(V/V/V),流速1.0ml/min,荧光检测,激发波长330nm,发射波长450nm,邻苯二甲醛(OPA)进行柱前衍生,室温下检测。

结果:ADMA在0.05~5μg/ml范围内有良好线性关系,最小检出量为0.05μg/ml,平均相对回收率为(93.76±2.57)%,日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。

结论:本方法准确、简便、快速,适用于科学研究和临床检测。

【关键词】非对称性二甲基精氨酸、色谱法、反相高效液相

血浆中非对称性二甲基精氨酸(Asymmetricaldimethylarginine,ADMA)浓度变化与心血管疾病发生发展密切相关,近年来研究显示ADMA升高是一种新的心血管病危险因素[1]。关于血浆中ADMA浓度的检测方法,国外虽已有报道[2,3],但操作繁琐,干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道[4]。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进,采用反相色谱法,用一元线性梯度洗脱,建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法,报告如下。

1材料

1.1试剂

AMDA标准品、衍生剂OPA、3-巯基丙酸均购自Sigma公司,HPLC分析纯度>99.99%;甲醇为一级色谱纯,购自天津市四友生物医药科技有限公司;硼酸为一级色谱纯,购自上海试剂总厂;乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯,购自上海试剂总厂。超纯水(18.25MΩ?cm)。

1.2仪器与设备

高效液相色谱仪为Agilent1100系列,包括G1322在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321AFLD荧光检测器;自动进样器;Agilent化学工作站(RevA.08.03.[847])。高速离心机(TGL-16G,上海安亭科学仪器厂出品);漩涡混合器(XW-80A,上海医科大学仪器厂生产);电子分析天平(AB204-A,上海梅特勒-托利多仪器公司灵敏度0.1mg);超纯水制备机(杭州永洁达净化科技有限公司生产)。

1.3AMDA工作液配制

准确称取ADMA标准品10mg于100ml容量瓶中,用超纯水溶解并定容,得浓度为100μg/mlADMA储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的ADMA工作液,贮存于4℃备用。

1.4流动相A配制

精密称取乙酸钠4.1g,用重蒸水溶解后,在1000ml容量瓶中定容,用2mol/L冰乙酸调节pH值到6.8,即得浓度为0.05μmol/L,pH6.8的乙酸钠溶液,然后用0.45μm滤膜过滤,超声脱气。

1.5OPA衍生剂配制

精确称取OPA20mg,加400μl的甲醇,0.2mol/L硼酸3.6ml(pH=9.5),3-巯基丙酸20μl,混匀避光(现配,现用)。

2方法和结果

2.1色谱条件

色谱柱:WatersSymmetryC18柱(5μm,3.9mm×150mm),保护柱:WatersSymmetryC18保护柱(5μm,3.9mm×20mm);流动相:A为0.05μmmol/L乙酸钠(pH6.8),B为甲醇,按B14%15min,31%25min,45%5min(V/V/V)梯度洗脱;进样量20μl;流速1.0ml/min;柱温40℃;荧光检测波长:激发波长330nm,发射波长450nm。

2.2血浆样品处理方法

于1.5ml离心管(EP管)中精密加入待测血浆1.0ml,加入20mg5-磺基水杨酸,漩涡混匀5min,冰浴15min,于12000r/min离心10min,吸取上清液。

2.3样本柱前衍生

取“2.1”中上清液100μl,加OPA衍生剂100μl,漩涡混匀避光2min后,上机,自动进样检测,色谱图见图1,可见血浆中ADMA峰形良好,分离完全,无杂质峰干扰。

2.4标准曲线的制备

于7支1.5ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的AMDA工作液,再各加入人空白血浆,配成终浓度依次为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的血浆标准品溶液系列。再按血浆样本处理方法处理后分别测定,并记录色谱图,以峰面积为纵坐标,ADMA浓度为横坐标进行线性回归,得直线回归方程Area=60.90027848×Amt+3.5852958,r=0.99973,最小检出量0.05μg/ml,其含量在0.05~5.0μg/ml之间有良好的线性关系。

2.5精密度试验

按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后,日内衍生5次,隔日再衍生5次,分别计算日内变异和日间变异。结果见表1。

2.6回收率试验(相对回收率)按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法处理后测其浓度,以实测浓度与配制浓度之比乘以100%计算ADMA的相对回收率,重复试验5次。结果见表2。

3讨论

本研究方法在国内外同类研究的基础上进行了适当改进,采用线性梯度洗脱。线性梯度洗脱能缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度等。本研究中ADMA出峰干净,形态良好、对称,但出峰时间较其他文献报道[3,4]却有所延长。这同血浆样本处理方式有很大的关系,国外同类研究对血浆样本采用固相萃取分离,因此出峰可不考虑血浆中其他杂质影响,而国内同类研究受实验条件的限制,对血浆样本仅采用血浆蛋白沉淀法,因此需排除血浆中其他杂质的影响。本研究采用5-磺基水杨酸血浆蛋白沉淀法,血浆蛋白沉淀较完全,但一开始杂质峰仍较多,因此采用线性梯度洗脱,调整出峰时间至19~20min,以减少杂质峰的干扰,结果显示ADMA目标峰出峰良好,形态对称。

本研究建立的血浆ADMA浓度RP-HPLC检测方法,采用OPA柱前衍生、线性梯度洗脱,具有快速、简便、色谱峰形佳,结果准确可靠等优点,血浆中ADMA最低检测浓度为0.05μg/ml,精密度和相对回收率均符合生物等效性指导原则的要求,而文献报道称健康人血浆ADMA水平是(1±0.1)μmol/L(0.275±0.028μg/ml)[5],因此本方法适用于科研试验研究和临床检测。

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