复方五仁醇胶囊保肝作用的血清药理学研究

【摘要】目的：建立复方五仁醇胶囊血清药理学研究方法。方法：建立CCl4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型，大鼠为含药血清供体，以含药血清对损伤肝细胞增殖(MTT法)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)泄漏的影响两个指标，结合含药血清中五味子乙素的含量测定，分别采用单因素考察、多因素的正交试验，优选含药血清的制备方法，并确定体系中血清添加量。结果：每天以成人等效剂量10倍的甲醇提取物间隔8h分两次给正常大鼠灌胃给药，连续3天，末次给药后2h采血制备含药血清比较合理，体系中加入10%该条件下制备的含药血清能明显提高损伤肝细胞的增殖能力、降低细胞ALT泄漏。结论：适宜条件下制备的复方五仁醇胶囊含药血清对肝细胞损伤具有明显的保护作用，血清药理学研究方法可以用于该制剂的药效评价。

【关键词】复方五仁醇胶囊;保肝作用;含药血清;血清药理学

中药“血清药理学”是指在动物经口服给药一段时间后采血分离血清，用此含药血清进行体外药理实验的一种实验方法，该方法作为中药研究的新思路和新方法而倍受推崇。复方五仁醇胶囊是我院研制的以五味子为君药的治疗慢性肝炎的科研制剂，我们对该制剂进行了“血清药理学”研究的方法学探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

SD大鼠，SPF级，体重230±19.8g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂与试药

羟乙基哌嗪乙磺酸(香港FARCO公司);乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(美国AMRESCO公司分装);胶原酶IV(美国Sigma公司分装);胰蛋白酶(美国Sigma公司分装);DMEM培养基(美国GIBCO公司);新西兰新生小牛血清(美国HyClone公司);四氯化碳(宜兴市第二化学试剂厂);溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑蓝(MTT，AMRESCO公司);五味子乙素(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心);复方五仁醇胶囊(本院自制)。

1.1.3仪器

HERAcellCO2培养箱(德国GmbH公司);BIO-TEK340酶标仪(美国Sigma公司);日立7170全自动生化分析仪(日本日立公司);Agilent1100Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠灌胃用药物的处理

取复方五仁醇胶囊内容物，加0.5%CMC-Na制成混悬液。另取复方五仁醇胶囊内容物，甲醇回流提取，加0.5%CMC-Na制成混悬液。

1.2.2肝细胞的分离与培养

按文献[1]方法分离大鼠肝细胞，并以1×105/cm2接种于96孔及48孔培养板中，置CO2培养箱(5%CO2)37℃培养。

1.2.3含药血清制备方法考察Ⅰ

给药形式及剂量考察取SD大鼠20只，随机分成5组(制剂原形组，提取物小剂量、中剂量、大剂量组和空白组)，每组4只，禁食12h。制剂原组组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃制剂混悬液，提取物小剂量、中剂量和大剂量组同法分别灌胃5、10和20的提取物混悬液，连续给药3天，末次给药后1h颈总动脉取血，4℃过夜，分离血清，空白组每天0.5%CMC-Na灌胃，同法制备空白血清。

取培养24小时的肝细胞，吸弃上清液，随机分成6组(正常对照组，模型对照组，制剂原形组，提取物小剂量、中剂量、大剂量组)，每组设6个复孔。除正常对照组外，每孔加入含CCl4的DMEM及相应含药血清(模型对照组为空白血清)，CCl4和血清的终浓度分别为10mmol/L和10%，正常组相应加入DMEM培养液和空白血清。作用24h后，收集48孔板中培养上清液检测ALT。96孔板中每孔加入5mg/ml的MTT液20μl，继续孵育4h，每孔再加入DMSO200μl，振荡后，用酶标仪于波长570nm测吸光值A。

1.2.4含药血清制备方法考察Ⅱ

其他条件的正交试验考察以动物是否造模、给药间隔时间、取血时间、取血成分为考察因素，每个因素设2个水平(见表1)，选用L8(27)正交表安排试验。取SD大鼠32只，随机分成8组，每组4只，其中肝损伤模型大鼠给药前24h腹腔注射CCl41.0ml/kg。各组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃提取物混悬液，末次颈总动脉取血，血浆组血液立即离心分离血浆，血清组血液4℃过夜，分离血清。

取培养24h的肝细胞，吸弃上清液，随机分成8组，分别用以上制得的含药血清(血浆)按1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。

按文献方法[2]制备对照品及含药血清(血浆)供试品溶液，注入液相色谱仪，测定五味子乙素含量。

1.2.5体系中含药血清添加量考察

取培养24h的肝细胞，弃上清液，随机分成6组(正常对照组，模型对照组，5%、10%、20%、40%含药血清组)，每组设6个复孔。模型对照组和各含药血清组更换为加入CCl410mmol/L的DMEM培养液，正常对照组相应加入DMEM培养基，正常对照组和模型对照组加入终浓度为10%的空白血清，各含药血清分别组加入按1.2.4中正交试验1号方案制备的含药血清，使终浓度分别为5%、10%、20%和40%。作用24h后，按1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。