脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织的细胞凋亡

[摘要]目的观察脓毒症急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织的细胞凋亡。方法24只SPF级SD大鼠采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型，分别于CLP后0、12、36和72h颈椎脱臼法处死大鼠，取肺组织。行肺组织HE染色，观察病理变化，以透射电镜、TUNEL法检测细胞凋亡。结果HE染色可见，CLP后12、36、72h肺泡间隔增宽，间质充血水肿，肺泡腔变窄，炎症细胞渗出。TUNEL法检测发现，CLP后12、36、72h肺组织内细胞凋亡指数（AI）增加，其中36hAI值最高（p<0.01）。透射电镜证实细胞凋亡的特征性改变。结论脓毒症大鼠肺组织的AI明显增加，细胞凋亡可能在脓毒症ALI发生、发展中起着重要作用。

[关键词]：脱噬作用；脓毒症；肺损伤

脓毒症(sepsis,又称全身性感染)是临床危重病患者主要的死亡原因之一，目前尚无治疗脓毒症的有效方法。在美国每年有75万人发生脓毒症，其中有21万人死亡[1]，因此深入研究脓毒症的发病机制具有非常重要的意义。近年来国内外研究发现，细胞凋亡在脓毒症的发生、发展中起了重要的作用，淋巴细胞凋亡将导致免疫抑制，实质性脏器的细胞凋亡促进器官功能的损伤。本研究旨在观察脓毒症ALI大鼠肺组织的细胞凋亡及其在ALI发生发展中的作用。

材料和方法

1实验动物健康成年雄性SPF级SD大鼠24只，体重250-300g，由浙江省医学科学院动物中心提供。

2模型的构建3％硫喷妥钠腹腔注射麻醉，行盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型。参照Chaudry等[2]的方法，腹正中线切开2cm切口，在距离盲肠盲端1~2cm处以1号线结扎，用18号穿刺针在结扎处远端穿刺盲肠两次，为防止针孔闭合，将1/4长的18号穿刺针外套管贯通盲肠，并用1号线将外套管牢固固定于肠壁。盲肠还纳入腹腔，关腹。

3标本采集和处理分别于CLP后0h、12h、36h、72h颈椎脱臼法处死大鼠，立即将肺取出。

4检测指标

（1）形态学观察HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理变化；醋酸铀－枸橼酸铅双重染色，TECNA10电镜观察细胞凋亡。

（2）末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL法）肺组织以10％福尔马林固定6~24小时后，切成4μm厚的石蜡切片。石蜡切片按原位细胞凋亡试剂盒（试剂盒购自Roche公司，显色剂AP-red购自北京中山生物技术有限公司）提供的方法操作，光学显微镜下观察并计数。

5统计学分析数据以均数±标准差（(((s）表示，用SPSS11.0软件对数据进行统计学分析处理。采用单因素方差分析（One-WayANOVA）对数据进行比较，P<0.05为差异具有显著性意义。

结果

1病理组织学观察

肺组织HE染色可见CLP后12h肺泡间隔增宽,炎症细胞渗出，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，肺泡腔狭窄。36、72h肺组织病理学改变加重，肺泡间隔明显充血、增宽，大量炎症细胞渗出，肺泡腔明显狭窄，有时可见肺实变。

2透射电镜

TECNA10电镜下可见CLP后12、36、72h凋亡细胞染色质浓集，边聚，核固缩，胞膜完整，有时可见凋亡小体，肺泡上皮细胞板层小体排空现象增多，出现大量空泡。

3TUNEL检测结果

光学显微镜下观察，凋亡阳性细胞核呈红色着染。同一切片随机取5个高倍镜视野(×400)，计算细胞中平均阳性细胞的凋亡指数（ApoptosisIndex，AI）[3]。可见CLP后12、36、72hAI均比0h高（P<0.01），其中36h的AI最高，随CLP时间延长AI呈先增加后降低的趋势。不同时间点肺组织的AI见表1。凋亡细胞包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞等炎症细胞。表1：大鼠CLP后肺组织内AI的比较注：各时间点与0h比较：*P<0.01

讨论

脓毒症是引起ALI最常见的病因，利用盲肠结扎穿孔复制脓毒症自70年代起就已应用于动物实验研究中，这一模型与临床上常见的肠穿孔引起的腹膜炎较为接近，有较高的研究价值，其发生、发展的机理主要是腹腔内病原微生物入侵、感染后，机体过度产生炎性分子，使肺组织中的上皮细胞、血管内皮细胞等细胞间粘附分子表达上调[4,5]。本研究通过CLP复制脓毒症模型，发现CLP后12～72h各时点大鼠肺组织均呈现肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润，毛细血管扩张、出血，肺泡结构破坏等病理改变，随时间延长病变程度加重，表明ALI的模型复制成功。

本实验通过透射电镜发现CLP12～72h后肺组织内发生细胞凋亡，通过TUNEL法定量观察到12～72h各时间点AI明显增加，凋亡细胞包括支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞等炎症细胞。脓毒症最重要的并发症（后续症）是器官功能障碍，细胞凋亡在脓毒症ALI中的作用可能有，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞凋亡导致血管壁和肺泡壁通透性增高，渗出增加，引起肺泡弥散功能下降，大量淋巴细胞凋亡导致机体免疫功能紊乱，影响了促炎抗炎反应的平衡，共刺激分子表达能力下降，细胞免疫功能下降[6]。

本实验中还发现CLP后12～72h肺组织内AI呈先增加后降低的趋势，可能因为随着CLP时间延长部分细胞发生坏死，同时大量凋亡细胞被吞噬细胞清除，细胞凋亡是一个动态发展的过程。

综上所述，脓毒症时肺组织内大量细胞发生凋亡，调控细胞凋亡将有助于脓毒症器官功能损伤的防治。