正交试验法优化茵栀黄颗粒提取工艺

【摘要】优化茵栀黄颗粒的提取工艺。[方法]以干膏得率和绿原酸提取率为考核指标，采用正交设计法对茵栀黄颗粒水提取工艺进行考察。[结果]茵栀黄颗粒最佳提取工艺的方案为A2B1C2，即加水量为8倍，提取2次，每次1h。[结论]优选的提取工艺科学合理，适于大规模生产。

【关键词】茵栀黄颗粒、高效液相色谱法、正交试验、提取工艺

茵栀黄颗粒系由中药茵陈、栀子、黄芩经水提醇沉工艺而制成的颗粒剂，具有解热利尿、保肝降酶、退黄利胆的作用，用于治疗各种黄疸性肝炎。本实验采用正交设计方法，以干膏得率和绿原酸提取率为指标，对茵栀黄颗粒水提取工艺进行优化研究。

1仪器与材料

Waters600高效液相色谱仪，Waters600E四元泵，Waters2996PDA检测器，Empower工作站。

绿原酸对照品(供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110753?200212。药材购于义乌市医药有限公司，经鉴定符合《中国兽药典》2000版(二部)[1]规定。水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯(上海陆都化学试剂厂)，磷酸为分析纯(浙江三鹰化学试剂有限公司)。

2方法与结果

2.1正交试验设计选用L9(34)正交表，以干膏得率和绿原酸提取率为考核指标，考察水提取中的加水量(A)、煎煮时间(B)和煎煮次数(C)3个因素，每个因素设3水平。其因素水平见表1。

表1正交试验因素水平表(略)

2.2样品提取液的制备按处方配比称取药材适量，按正交试验表进行水提取，药液经滤纸滤过，滤液浓缩至1∶1.5(药材∶药液)，备用。

2.3干膏得率的测定精密量取上述提取液20ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥至恒重，计算出干浸膏得率，结果见表2。

2.4绿原酸含量的测定(1)色谱条件色谱柱为Symmetry?RC18柱(4.6×250nm，5mm);流动相为乙腈?0.4%磷酸水溶液(8∶92);流速：1mL/min;进样量：20mL;柱温：30℃;柱效：理论板数不低于4000。在此条件下，绿原酸与其他组分能达到较好分离,峰纯度达到要求，见图1。

图1绿原酸对照品与样品的高效液相色谱图(略)

1.对照品;2.样品

(2)对照品溶液的制备精密称取绿原酸度对照品4mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得。(3)供试品溶液的制备精密吸取提取液1ml，置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，摇匀，离心，用微孔滤膜(0.45mm)滤过，取续滤液避光保存，作为供试品溶液。(4)标准曲线的制备精密量取绿原酸对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置10ml量瓶中，加入0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，混匀，以微孔滤膜(0.45mm)滤过。各取续滤液20μl分别注入液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品的进样量(μg)为横坐标作图(见图2),得到一条直，其回归方程：y=26.083x?0.0772(r=0.9999)，说明绿原酸在0.1616～1.2928mg范围内，与峰面积之间呈良好的线性关系。

图2绿原酸对照品的标准曲线(略)

(5)精密度考察精密吸取对照品溶液20μL，连续进样5次，在上述色谱条件下测定绿原酸对照品的峰面积，平均峰面积为1609030;RSD=0.67%。(6)稳定性试验精密吸取供试品溶液20μl，分别于0、1、2、3、4和6h进样，测定供试品溶液中绿原酸的峰面积，RSD=1.07%，说明样品溶液在6h内稳定。(7)重现性试验精密量取同一批提取液5份，按供试品溶液的制备项下制备试液;进样20μl，测定峰面积，RSD为1.24%，重现性良好。(8)回收率试验精密量取已知含量的提取液6份，置10ml棕色量瓶中，分别加入绿原酸对照品，按供试品溶液的制备项下制备试液;进样20μl，依法测定绿原酸含量，计算回收率，结果见表3。平均回收率为99.19%，RSD=1.26%。(9)含量测定精密量取对照品溶液4ml置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45mm)过滤，制成每1ml含绿原酸32μg的对照品溶液。精密吸取提取液1ml，置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，摇匀，离心，用微孔滤膜(0.45mm)滤过，取续滤液避光保存，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ml;注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，结果见表2。

表3回收率试验结果(略)

表2正交试验结果(略)

2.5结果分析方差分析结果见表4和表5。以干膏得率为考察指标，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>A>B;方差分析结果表明：C因素影响有显著性差异(P<0.01)，A和B因素对干膏得率则无显著性影响(P>0.05)，以A3B3C3组合为佳。以绿原酸提取率为考察指标，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>A>B;方差分析结果表明：A因素和B因素对绿原酸提取量无显著性影响(P>0.05)，而C因素的影响有极显著性差异(P<0.05)，以A2B1C2组合为佳。

表4浸膏得率方差分析表(略)

表5绿原酸提取率方差分析表(略)

2.6验证试验鉴于绿原酸提取量这一指标较重要，同时兼顾省时节能，故拟确定水提取工艺为A2B1C2。取同一批药材，按处方比例称取药材按A2B1C2进行验证试验，按上述方法测定干膏得率及绿原酸提取率，结果见表6。

表6验证试验结果(略)

由表6可见，A2B1C2工艺提取的干膏得率和绿原酸提取率均与原4号样品无显著差异，故确定水提取工艺为A2B1C2，即加水量为8倍，提取2次，每次1h。

3讨论

茵栀黄颗粒系复方制剂，成分复杂。根据方中各药的有效成分及其溶解性能，设计确定采用水提工艺。绿原酸系本方中主药茵陈的利胆活性成分和质量控制的指标成分[2,3]，也为本方中君药栀子中主要的有机酸类成分，具有显著的抗炎活性[4]。因此，除以干膏得率为考核指标外，同时测定绿原酸提取率，以综合评价工艺的合理性。本实验采用高效液相色谱法测定绿原酸含量，可不经分离，直接测定。方法简便、准确、灵敏，重现性及回收率均符合要求。