红曲菌株的RAPD多态性分析

【摘要】[目的]研究红曲分离株的遗传多样性和亲缘关系，为种质鉴定、保护和利用提供参考。[方法]用随机引物对10个红曲菌株进行RAPD分析，从中筛选出63特征性好，多态性高的RAPD图谱，用NTSYS?PC?2.1软件进行同一性和差异性分析并根据遗传距离构建系统进化树。[结果]红曲分离株间的同一性平均73.32%，表明它们的遗传背景具有很大的相似性;RAPD聚类结果与菌株的形态差异相关，表明RAPD分子标记进行菌株鉴别与传统形态分类鉴别结果基本一致，鉴别能力较强。[结论]基于RAPD多态性的遗传分析能从分子水平上揭示红曲菌的遗传背景差异，为分类鉴定、种质起源和系统进化提供辅助手段和技术依据。

【关键词】红曲菌;RAPD分析;遗传同一性;系统进化树

红曲是一味在《本草纲目》、《医林纂要》等都有记载的天然佳品。长期以来，对红曲菌分类鉴定均根据其形态特征和生理学特性[1?4]。由于红曲菌属下分类的形态、生化指标均受培养基质、温度等环境条件影响，表现出较大差异性，加上有些种界限不明确，使红曲菌的命名和分类在学术上颇多争议[5]。

DNA分子在物种鉴别分类和筛选上比形态学、血清学、化学指纹图谱等更准确，目前已有限制性酶酶切片段长度多态性(RFLP)，随机扩增多态DNA(RAPD)，串联重复序列(SSR)等[6]直接在DNA水平上进行遗传分析的实验方法。由于红曲菌的分子生物学研究起步较晚，基因组序列相关信息尚不清楚，限制了常规分子生物学方法的使用。RAPD标记技术不需要预先知道DNA序列信息，对DNA质与量要求不高，引物无种属界限[7]等优点使其成为研究红曲菌株鉴别、遗传分析的首选。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1供试菌株及培养基：供试红曲菌株编号1～10依次为AS3.554、AS3.972、B、F、J、M?2、P、S、ZW?5、古田，其中F为Monascusruber，余为Monascusanka.。B、F、J、P、S由浙江中医药大学肿瘤研究室保存，AS3.554、AS3.972、M?2、ZW?5、古田购自浙江省微生物研究所，AS3.554、AS3.972为中国普通微生物菌种保藏中心保存菌株。MEA(maltextractagar)[6]培养基。

1.1.2主要试剂及随机引物：主要分子生物学试剂购自杭州博日科技有限公司及宝生物工程(大连)有限公司，RAPD分析所用1O碱基随机引物S251?S350、S2001?S2050购自上海生工生物技术公司，编号及核苷酸序列见上海生工生物技术公司网页。

1.2实验方法

1.2.1红曲基因组DNA的提取：红曲菌体基因组DNA的提取采用CTAB法[8]进行。

1.2.2RAPD反应体系：RAPD反应体系为1×PCRBufer，dNTPs1mmol/L，Taq酶1.2U，随机引物0.2μmol/L，模板DNA20ng，反应总体积为20μL。

1.2.3RAPD反应参数：扩增反应在梯度PCR扩增仪上进行，94℃预变性6min，进入92℃变性40s、36℃退火40s、72℃延伸2min的35个循环，最后72℃补平7min，4℃终止反应。

1.2.4RAPD多态性分析：根据片段大小排列并记录,条带有计为“1”;条带无计为“0”，构建原始数据0?1矩阵，用NTSYS?PC?2.1软件计算出同一性和差异性，并用clustering中的UPGMA聚类方法构建系统进化树;用Editfile生成遗传同一性和差异性表。

2结果

2.1红曲菌的RAPD电泳图谱：用150条随机引物扩增10株红曲菌基因组DNA，筛选出条带多，特征性好，多态性高的63个电泳图谱作为RAPD分析依据。不同红曲分离株RAPD扩增产物有3～9条带，多集中在300～1500bp，其中主条带2～4条，次带丰富，各菌株间既有相同条带又有差异条带，如图1。

2.2RAPD多态性分析：从选出的63个RAPD图谱发现,10株红曲菌指纹图谱条带基本一致,说明其遗传背景有很大相似性，但个别谱带之间存在不同程度差异，说明不同红曲分离株间又有丰富的遗传多样性。统计记录电泳结果，获得344条电泳条带的0?1矩阵。用NTSYS?PC?2.1计算10株红曲分离株遗传同一性和遗传差异性见表1，红曲分离株间同一性为36.05～86.05%,平均73.32%。聚类分析结果见图2，其中AS3.544与B、S与ZW-5的亲缘关系较近，尤其是AS3.972与古田同一性高达86.05%，遗传距离非常接近，它们可能有共同祖先。F处于相对独立的一支，与其它红曲菌亲缘关系均较远。

3讨论

本研究显示虽然10株红曲菌来源各异，但同一性平均高达73.32%，说明其遗传背景有很大相似性，这与邢旺兴等[9]的结果一致。结合形态学特征发现RAPD遗传分析结果与菌株间的形态差异相关，如：RAPD多态性提示F与其它红曲菌同一性仅有40%左右，多态性较高，很可能与种间差异有关，菌落形态和显微镜检表明F属M.ruber种而AS3.554、B等则属M.anka种。这表明RAPD指纹图谱能较好地反映红曲菌株间的遗传关系，鉴别能力较强。均分离自福建的AS3.972和古田有地理距离优先聚类倾向,同一性高达86.05%，遗传距离非常近，表明地缘关系也是系统分类、遗传进化重要影响因子。

本研究利用分子生物学和数值分类方法研究红曲菌种质资源，从分子水平揭示红曲菌遗传背景差异，其结果与传统分类结果基本一致，表明RAPD分析具有较强菌株鉴别能力，不仅可作为一种辅助鉴别工具提高鉴定的准确性和客观性，而且为进一步研究红曲种质起源和进化提供参考。