MGMT与肿瘤的预见性化疗

o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶(o6-methylguaninedna-transferase，mgmt)，是细胞修复dna损伤的一种酶，这种酶又被称为o6-烷基鸟嘌呤dna烷基转移酶(agat)。顾名思义，此酶可以修复由各种烷化剂(alkylatingagents)造成的细胞dna烷基化损伤，特别是dna分子中鸟嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化损伤。根据mgmt基因及其表达水平的不同，将细胞特别是肿瘤细胞分成mer+和mer-两种类型：mer+对烷化剂耐药，mer-对烷化剂敏感，即细胞中的mgmt水平决定了细胞对烷化剂的耐药程度;接着科学家集中精力研究如何克服mer+细胞耐药性的问题，发现o6-bg可以有效克服mer+细胞对烷化剂耐药性。这些研究为开展甲基转移酶mgmt与肿瘤预见性、个体化治疗奠定了基础。

1mgmt与肿瘤预见性、个体化治疗

化疗是治疗肿瘤的有效手段之一。影响化疗效果的主要问题是克服肿瘤对药物的耐药性。因此在化疗之前，预先判断患者对药物是否耐药是实施肿瘤预见性、个体化化疗的前提。烷化剂类化疗药物占国产的化疗药物的1/4，这类药物的作用机制明确，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物主要攻击细胞的dna，造成dna烷基化损伤，进而形成dna交联，导致细胞死亡。在12种dna烷化损伤中，以o6-甲基鸟嘌呤dna的损伤威胁最大，是引起细胞致死的重要原因。文献报道细胞内的o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶可使dna烷基化特别是甲基化的损伤得到修复，是细胞对烷化剂药物产生耐药性的根本原因[1～3]。如果能够建立检测肿瘤细胞中mgmt的方法，就可以依据mgmt酶活性或酶蛋白水平的高低，合理使用烷化剂类药物：即对mgmt蛋白水平低的肿瘤直接使用烷化剂化疗，而对mgmt蛋白水平高的耐药的肿瘤，设法降低其mgmt蛋白水平，破坏其耐药的分子基础，然后使用烷化剂治疗。中国人肿瘤细胞中mgmt是如何分布的、肿瘤患者mgmt的分布有什么规律、能否通过动物实验验证mgmt蛋白水平高低与对药物耐药或敏感的相关性、能否研制出mgmt诊断试剂盒、能否研制出更有效的烷化剂类治疗药物嘧啶亚硝脲(acnu，尼莫斯汀)、能否研制出克服肿瘤细胞对烷化剂特别是对亚硝脲耐药的药物，如这些问题得到解决，就可以形成以分析肿瘤病人mgmt为依据、以调节mgmt为手段，对mgmt蛋白水平不同的病人，实施不同的使用烷化剂治疗的方案，实现预见性、个体化化疗。

自1987年始，历经14年，我们先后进行了20株中国人肿瘤细胞系mgmt酶活性与对烷化剂亚硝脲耐药性的分析、裸鼠治疗实验、mgmt基因结构与转录、mgmt基因转导对耐药性的影响、初步的临床治疗实验等，率先提出了分析甲基转移酶蛋白水平，进行肿瘤预见性、个体化化疗的方案，并研制出国家一类新药甲基转移酶检测试剂盒，研制出相应的治疗药物嘧啶亚硝脲(尼莫斯汀)和克服耐药性的药物链脲菌素(链佐星)，实现了与此方案相关的药物全部配套并国产化，为推行以分析肿瘤病人mgmt为依据，以调节mgmt为手段，对mgmt蛋白水平不同的病人，实施不同的使用烷化剂治疗的方案，奠定了基础。

我们收集和培养了20株中国人肿瘤细胞，包括肝癌4株、肺癌4株、鼻咽癌2株、脑瘤2株、胃癌2株、恶性黑色素瘤、直肠癌、舌癌、乳腺癌、食管癌和宫颈癌各1株，以国际公认的helas3(mer+型)和helamr(mer-型)细胞为对照，测定了它们的mgmt酶活性，及烷化剂acnu和bcnu处理后的细胞存活率。实验证明20株中国人肿瘤细胞对烷化剂亚硝脲的敏感性呈3种类型：第一类敏感型，如shg-44脑恶性胶质瘤细胞;第二类抗性型，如bgc-823胃癌、bel-7402肝癌和smmc-7721肝癌细胞;第三类中间型。在20株中国人肿瘤细胞中，mgmt活性低的2株，占10%。这一结果与美国scudiero报道的mgmt活性低的细胞为20%(19/93)[4]，日本ikenaga报道的为15%(6/40)[5]基本相当。进一步的mgmt酶活性分析揭示，在实验的20株细胞中，对亚硝脲敏感型的shg-44和helamr细胞的mgmt酶活性最低;对亚硝脲呈抗性的bgc-823、bel-7402、smmc-7721和helas3细胞的酶活性都很高。如果用细胞存活率为10%时所对应的药物浓度(d10值)作为衡量细胞对药物敏感性的指标，则细胞d10值与mgmt酶活性之间有很好的线性关系，mgmt酶活性高的细胞对亚硝脲有抗性，mgmt酶活低的细胞对亚硝脲药物敏感(见图1)。说明mgmt酶活性高低是决定肿瘤细胞对烷化剂耐药性的分子基础。

为了进一步观察肿瘤细胞mgmt酶活性与使用烷化剂药物治疗效果的关系，watatani把mgmt酶活高和酶活低的两种不同肿瘤细胞植入裸鼠体内，然后使用单功能烷化剂mnng治疗，结果mgmt低的肿瘤明显治愈，而mgmt高的肿瘤表现出耐药性[6]。我们将1×107mgmt低的helamr细胞以及中国人shg-44脑胶质瘤细胞，相同数量的mgmt高的helas3和smmc-7721中国人肝癌细胞接种到裸鼠体内，待成瘤后按每克鼠体重腹腔注射25μg烷化剂acnu的剂量进行治疗，每周1次，连续4周;或将acnu的剂量提高到50μg/次，治疗2次。helamr和shg-44肿瘤移植物消失，继续观察1个月未见复发，治疗效果十分理想。而烷化剂acnu对mgmt高的helas3和smmc-7721肿瘤移植物则无治疗效果，肿瘤移植物越长越大(见图2)。光学显微镜和电子显微镜观察证明，从裸鼠体内剥离出的治愈的mgmt低的肿瘤残存物中，仅能见到明显坏死的细胞和少量纤维细胞或脂肪细胞。实验充分说明烷化剂acnu对mgmt低的肿瘤细胞有很强的杀伤

图1中国人肿瘤细胞mgmt活性与对acnu敏感性关系

1.helamr/helas3(acnu0，对照);2.helamr/helas3(acnu25μg/g×4);9.helamr/helamr(acnu50μg/g×2);

图2acnu对人肿瘤移植物的治疗效果

作用，进一步证明肿瘤细胞对烷化剂的耐药性与mgmt酶活性相关。提示如果能检测并确定肿瘤细胞中mgmt酶活的高低，就有可能预见烷化剂药物的治疗效果。

另一类常用烷化剂顺铂的治疗效果也与肿瘤细胞内的mgmt酶活性相关。文献报道顺铂可降低mgmt酶活与酶蛋白水平，克服肿瘤细胞对烷化剂氮烯咪胺(dtic)、替莫唑胺(tmz)的耐药性[7]。mgmt酶可修复顺铂造成的肿瘤细胞染色体sce，对抗顺铂药物作用;mgmt酶活高的肿瘤细胞对顺铂耐药，mgmt酶活低的细胞对顺铂敏感[8]。更有实验证明使用顺铂和环磷酰胺对卵巢癌的治疗效果与肿瘤细胞中的mgmt酶活性相关[9]。环磷酰胺、顺铂和亚硝脲的实验结果充分说明细胞的mgmt酶活性，决定了烷化剂药物对肿瘤的治疗效果。

不同的肿瘤细胞mgmt酶活性不同，有的高，有的低。肿瘤病人的肿瘤组织中mgmt酶活性是否也存在个体差异呢?我们分析了74例不同类型的肿瘤组织中mgmt酶活性，包括乳腺癌9例，胃癌、小细胞肺癌、肾癌、食管癌和结肠癌各5例，非小细胞肺癌24例，脑瘤14例及恶性黑色素瘤2例。发现在这些肿瘤组织中mgmt酶活性由高到低的顺序为乳腺癌>胃癌>小细胞肺癌>非小细胞肺癌>肾癌>脑瘤>食管癌>结肠癌>恶性黑色素瘤，这种组织分布规律性与临床使用烷化剂治疗肿瘤的经验基本吻合，即烷化剂药物多用于治疗酶活性低的肿瘤。同时我们还观察到即使在同种肿瘤组织中mgmt酶活性也有个体差异。在74例标本中有6例mgmt酶活性极低，包括食管癌3例，肺腺癌、脑胶质母细胞瘤和结肠癌各1例，约占8.1%。这一结果与日本isowa观察到21例肝癌中，mgmt低的占9.5%[10];意大利frosina观察到27例脑瘤中mgmt活性低的占7.4%的结果相当吻合[11]。不同个体mgmt活性不同，必然对烷化剂的治疗效果不同。如果对这些mgmt低的患者使用烷化剂药物治疗，就有可能获得满意的疗效。而对那些mgmt高的肿瘤患者，如能设法降低其mgmt水平，就有可能克服其对烷化剂的耐药性，获得较好的治疗效果。对mgmt酶活不同的肿瘤患者，实施不同的化疗方案，即个体化治疗方案，不仅可以减轻病人的痛苦，而且可以提高化疗的水平。

据此，我们进一步构建了含人mgmtcdna和选择标记neo基因的真核表达载体psv2mgmt-neo，并利用电穿孔基因转移技术将其导入mgmt基因表达水平低的helamr肿瘤细胞中，希望观察导入mgmtcdna是否可以改变mer-型肿瘤细胞对烷化剂的耐药性，经筛选获得了mgmtcdna转染细胞，实验证明5个转染细胞克隆中有4个mgmt酶活性和mgmtmrna表达水平均比转染前显著提高，随之带来的结果是转染细胞产生对双功能烷化剂acnu和单功能烷化剂mnng的耐药性。实验结果充分证明人mgmt基因表达与肿瘤细胞对烷化剂的耐药性有直接的关系，mgmtmrna和mgmt蛋白表达水平的提高是肿瘤细胞对烷化剂药物产生耐药性的直接原因。

2联合用药克服肿瘤细胞对烷化剂的耐药性

以上实验充分证明mgmtmrna、mgmt酶蛋白和酶活性的高低决定了肿瘤细胞对烷化剂的耐药性。mgmt高耐药，mgmt低敏感。这就提示如果能降低或消耗肿瘤细胞的mgmt酶活性和蛋白水平，就有可能克服肿瘤细胞对烷化剂的耐药性。我们选用3株mer+型肿瘤细胞为实验材料(包括helas3，smmc-7721和cc801)，这3株细胞的mgmt活性均较高，因此对acnu和bcnu烷化剂类药物表现出不同程度的耐药性。我们观察了使用链脲菌素(streptozotocin，stz)对mer+型细胞耐药性的改变，3株mer+型肿瘤细胞于37℃用链脲菌素处理1h后，细胞的mgmt活性明显降低。当stz的浓度为1.5mmol/l时，可使helas3的mgmt活性从1.10pmol/mg降到0.59pmol/mg;当stz的浓度为1.0mmol/l时，可使smmc-7721的mgmt活性由0.77降到0.39;当stz浓度为0.5mmol/l时，可使cc801的mgmt活性从0.39降到0.14。这3株细胞mgmt酶活性下降后，细胞对acnu的耐药性也随之降低，d10值的改变：helas3从114μg/ml降到68μg/ml，smmc-7721从77μg/ml降到47μg/ml，cc801从39μg/ml降到23μg/ml;如果stz的浓度提高到3.0mmol/l、2.0mmol/l、1.0mmol/l时，分别可使helas3、smmc-7721和cc801的mgmt酶活降到0.01pmol/mg，与标准的mer-型的helamr细胞相当。这3株mer+型肿瘤细胞对acnu的d10值也均降到与helamr细胞相当的d10=10μg/ml水平，3株mer+型细胞对acnu的耐药性随之消失。同样，stz浓度为3.0mmol/l、2.0mmol/l和1.0mmol/l时，可使helas3、smmc-7721、cc801对bcnu的d10值均下降到与helamr相当的水平，细胞对bcnu耐药性也随之消失。动物实验也证明首先用100μg/gstz处理，然后再使用25μg/gacnu治疗，可将单独使用acnu治疗无效的helas3肿瘤细胞移植物有效地治疗。实验结果充分证明使用合适浓度的链脲菌素可以有效地克服mer+型肿瘤细胞对烷化剂类药物的耐药性。为临床开展stz和acnu联合化疗提供了参考和依据。通过体外和体内实验，我们还证明o6-苄基鸟嘌呤(o6-benzylguanine，o6-bg)能够更快速、更有效地抑制mer+型helas3宫颈癌细胞，smmc-7721中国人肝癌细胞，cc801中国人宫颈癌细胞的mgmt酶活性，从而有效地改变mer+型肿瘤细胞对烷化剂药物的耐药性。

在实验室研究的基础上，我们与中日友好医院合作，对mgmt高的、单独使用烷化剂嘧啶亚硝脲治疗无效的难治性脑瘤病人，开展了stz伍用acnu的联合治疗试验，共观察了8个病例。病例选择标准是：(1)复发恶性脑瘤;(2)经ct扫描证实单独使用acnu进行颈动脉灌注治疗无效;(3)具有可评价的病灶;(4)预期存活大于12周;(5)距上次acnu化疗至少6周;(6)患者wbc>4×109/l，血小板>100×109/l，肝肾功能正常。stz和acnu均经患侧颈动脉灌注给药。stz(2g/m2)灌注1h后，再同样灌注acnu(2～3mg/kg)，重复给药间隔最少12周，疗效由ct扫描判定。观察结果令人鼓舞，8例对acnu呈耐药性反应的患者，1例达到cr(可测肿瘤全部消失)，2例达到pr(肿瘤体积减小在50%以上)，4例nc(瘤体积减小<50%)，1例pd无效(瘤体积增加>25%)。cr加pr达37.5%(3/8)。临床试验初步证明，使用stz可以克服部分脑瘤患者对acnu的耐药性，联合使用stz与acnu可以收到理想的化疗结果。

在系统研究肿瘤细胞mgmt与其对烷化剂药物耐药性关系的基础上，我们提出了以分析肿瘤细胞mgmt酶活为依据，以调节mgmt活性为手段，克服肿瘤细胞耐药性，合理使用亚硝脲等烷化剂药物，对肿瘤进行预见性、个体化治疗的新方案。

3mgmt检测试剂盒的研制用单克隆抗体技术制备抗人mgmt单抗。采用抗碱性磷酸酶抗体与碱性磷酸酶形成的复合物(apaap)检测系统组装成mgmt诊断试剂盒。即第一抗体与待测抗原结合后，第二抗体(羊抗鼠igg)起桥联作用，其中一个fab段连接第一抗体，另一个fab段连接apaap，通过apaap复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色，以鉴定相应mgmt抗原物质。

3.1mgmt优势抗原表位的确定我们采用dnastar软件分析mgmt蛋白的空间结构，特别是分析其氨基酸序列的抗原指数、亲水性和表面的可能性3个指标。发现3个肽段作为抗原决定簇的可能性较大，其中以8～20段最好。故我们选择此肽段作为半抗原，与klh交联后制备全抗原。

3.2mgmt抗原的制备(1)mgmt优势抗原14肽的合成：采用fmoc-氨基酸-hbtu-hobt-rink树脂固相合成法，合成mgmt优势抗原表位的氨基酸序列，共计14肽，作为半抗原。(2)多肽与载体蛋白交联：选择钥孔虫戚血蓝素(keyholelimpethemocyanin，klh)作为半抗原载体。采用mbs法将半抗原多肽与klh连接，作为全抗原。

3.3免疫动物用全抗原免疫6～8周龄雌性balb/c小鼠，间接elisa法测定效价，选择效价最高的小鼠，腹腔加强免疫。

3.4抗人mgmt单抗杂交瘤细胞的制备(1)滋养细胞的制备：从小鼠腹腔中收集淋巴细胞，用作滋养细胞。(2)免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合：制备免疫小鼠的脾细胞，与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经hat选择性培养基筛选，获得杂交瘤细胞。(3)分泌抗人mgmt单抗杂交瘤细胞的克隆化：用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行多次亚克隆，使其单克隆化。

3.5杂交瘤细胞鉴定鉴定项目包括抗体分泌稳定性、细胞染色体核型分析。

3.6抗人mgmt单抗的大量制备(1)制备mgmt腹水单抗：收集处于指数生长期的杂交瘤细胞，接种到小鼠腹腔，约7～10天取腹水，并测效价。(2)制备硫酸铵沉淀粗提纯mgmt单抗：小鼠腹水加入饱和硫酸铵使成33%饱和度，沉淀用适量抗体稀释液溶解。(3)制备亲和层析纯化mgmt单抗：硫酸铵沉淀的单抗溶解后，用pharmaciabiotech.公司的aktafplc蛋白层析仪，使用hitrap?proteing-sepharose层析柱，对单抗进行亲和层析纯化。

3.7抗人mgmt单抗的鉴定鉴定项目包括单抗免疫球蛋白igg亚型、单抗纯度与浓度、单抗反应特异性、单抗效价等。结果证明，我们制备的mgmt单抗为igg1亚型;硫酸铵沉淀粗纯化单抗纯度为80%以上，亲和层析后纯度达到98%以上;制备的单抗只与mgmt抗原发生特异性结合;抗体最佳工作浓度为1∶40。

3.8mgmt诊断试剂盒组分见表1。

表1mgmt诊断试剂盒组分

我们首次用合成优势抗原多肽的方法生产出可与细胞内活性mgmt反应的单抗，并组装成诊断试剂盒，获得国家一类新生物制品新药证书，可在临床上推广使用。

在完成mgmt免疫组化诊断试剂盒的同时，我们还与军事医学科学院放射医学研究所、北京鲁银利华医药科技发展有限公司、北京高博药物化学技术开发有限公司、北京世纪华宇生物技术有限公司合作，成功地研制了烷化剂嘧啶亚硝脲尼莫斯汀(acnu)和抑制mgmt酶活性和酶蛋白的药物链脲菌素(链佐星stz)。使以分析mgmt为依据，实施上述肿瘤预见性个体化化疗的药物全部配套并国产化。

经过16年的研究，终于提出并完成了以分析肿瘤组织中mgmt蛋白表达水平为依据，以调节mgmt为手段，对mgmt表达不同的患者，实施不同的使用烷化剂治疗的方案。对临床使用烷化剂药物对肿瘤化疗具有重要的参考意义。可将化疗从凭经验、无针对性治疗提高到有预见性、有针对性的个体化治疗的新阶段。

4mgmt与肿瘤预见性化疗研究新进展

4.1预见肿瘤对烷化剂的耐药性cpg岛(cpgisland)常出现在某一基因启动子5’端和第一个外显子区域，长度约为200bp，在这个区域内gc含量高于正常规律。cpg岛甲基化可在转录水平调节基因表达，使相关基因沉默，去甲基化后又恢复基因表达。研究发现mgmt启动子区域cpg岛甲基化可使mgmt功能丧失，因此判断mgmt基因启动子cpg岛甲基化水平可以预见肿瘤细胞对烷化剂类药物的耐药性。

研究发现，对45例恶性黑色素瘤患者使用dtic或tmz化疗，同时对患者进行msp(methylationspecificpcr)分析。19例患者对dtic或tmz有反应，其中9例(9/19，47%)患者mgmt的启动子cpg岛发生甲基化。这9例患者中7例(7/9，78%)mgmt低表达。反之，26例患者对dtic或tmz无反应，26例中仅5例(5/26，19%)mgmt启动子cpg岛出现甲基化，5例中仅1例(1/5，20%)mgmt低表达。显示出mgmt基因启动子区域cpg岛甲基化与肿瘤细胞对烷化剂dtic或tmz的耐药性相关，提示msp方法有可能发展成为预见肿瘤细胞对烷化剂耐药性的指标。

4.2治疗用新的烷化剂替莫唑胺(temozolomide或temodar)3，4-二氢-3-甲基-4-氧代咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-8酰胺，是美国schering-plough公司开发的新一代烷化剂抗肿瘤药物，于1999年8月经fda批准上市，主要适应证为顽固性多形性成胶质细胞瘤(包括恶性神经胶质瘤、恶性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤)，由于其口服吸收性好、利用度高、组织分布好、可透过血-脑屏障、骨髓抑制作用小、副作用低而备受临床关注。替莫唑胺在体内可代谢生成烷基化的活泼基团-甲基肼，进而造成dna鸟嘌呤形成o6-meg。经临床使用初步证明替莫唑胺是优于亚硝脲类化合物的新一代治疗用烷化剂。

4.3克服肿瘤细胞对烷化剂耐药性的药物在上述肿瘤预见性、个体化治疗方案中，对mer+型细胞应首先使用药物抑制mgmt酶活性，克服耐药性，然后再使用烷化剂治疗，在经历了对o6-苄基鸟嘌呤的研究后，英国paterson肿瘤研究所与爱尔兰都柏林trinitycollege合作，先后研制出patrintm6{[(4-bromo-2-thenyl)methoxy]purin-2-amine}和patrin-2o6-(4-bromothenyl)guanine，初步试验证明patrin-2可以显著提高tmz对肿瘤细胞的治疗效果，有望发展成为抑制mgmt的新药物，可与tmz联合使用，对mgmt高的肿瘤细胞实施烷化剂治疗，欧美国家已组织成若干个协作组，共同对patrin-2的药效进行观察研究。

4.4如何保护正常组织在肿瘤化疗时，化疗药物“敌我不分”。既可杀伤肿瘤细胞，又可杀伤正常组织细胞。因此，如何提高正常组织细胞的耐药性，尽可能少地受到化疗药物的威胁，成为肿瘤化疗中的一个大问题。

研究发现，mgmt的突变体g156a和p140k对o6-苄基鸟嘌呤(o6-bg)有耐药性。如果将g156a或p140k基因通过逆转录病毒或慢病毒(lentiviral)介导的基因转染技术，导入来源于肿瘤患者正常的造血干细胞cd34+，然后用o6-bg筛选，获得转g156a或p140k基因的细胞，移植给肿瘤患者，再使用烷化剂(如bcnu、tmz等)和o6-bg联合化疗时，正常的骨髓造血干细胞会对药物产生一定的耐药性，而恶性肿瘤细胞则被化疗药物消灭。这一方案被称为stemcellselection，有望发展成为临床使用烷化剂治疗时的一项保护正常组织

综上所述，以mgmt为判断依据，使用烷化剂类药物对肿瘤实施预见性、个体化化疗的理想方案，见图3。