融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

【摘要】目的：构建pET28a?TAT?EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT?EGFP在细胞内的转导活性.方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段，插入载体pET28a后再连接EGFP基因，组成pET28a?TAT?EGFP重组表达子.转化大肠杆菌，IPTG诱导TAT?EGFP融合蛋白表达，组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞，观察荧光进入细胞的情况.结果：成功地构建了高表达pET28a?TAT?EGFP重组子，纯化了分子质量约为29ku的融合蛋白TAT?EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT?EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论：通过对TAT?EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用，为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.

0引言

随着生物工程技术的迅速发展,蛋白质与多肽类药物相继出现，但由于生物膜的屏障作用,只有少数小分子物质能进入组织，许多具有治疗作用的外源性生物大分子难以穿过生物膜在病灶达到有效浓度，从而给许多疾病的治疗造成困难.近年来发现一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV?1的转录激活因子(trans?activa?tor,TAT)，能够有效引导肽段或者蛋白质穿透细胞膜，其分子中具有蛋白转导作用的基本结构是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，这一多肽片段被称为蛋白转导结构域（Proteintransductiondomain,PTD).TAT的发现在蛋白功能和疾病治疗的研究中具有重要的应用价值.我们利用增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）作为报告蛋白，通过构建TAT与EGFP的融合表达载体，利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT?EGFP融合蛋白,并与培养的PC12细胞作用，观察能否穿过生物膜屏障,探讨TAT作为跨膜的细胞内传递作用，为蛋白类生物大分子的应用提供了理论基础.

1材料和方法

1.1材料pET28a质粒、E.coliBL21(DE3)(Novagen公司)；质粒pEGFP?N3，PC12细胞株由本试验室保存.T4DNA连接酶、NheI，XhoI，EcoRI，IPTG（华美生物工程公司）；质粒DNA小量纯化试剂盒（大连宝生物公司）；组氨酸亲和层析柱、咪唑（Pharmacia公司）；凝胶图像分析仪（美国Syugene公司）；HD1000核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；TAT双链与EGFP的引物合成及DNA测序由上海生物工程公司完成.

1.2方法

1.2.1TAT的合成按照TAT蛋白转导区48?60位氨基酸（YGRKKRRQRRR）的序列，人工合成了编码PTD的DNA片段：正义链为5′AAAgCTAgCggCTATggCCgTAAAAAACgTCgTCgTCgTggCgAATTCAAA3′，下划线分别为NheI，EcoRI酶切位点，反义链略.两段DNA片段在95℃变性30min后，置于90℃水浴的保温瓶中缓慢退火过夜，退火后得到双链片段.

1.2.2EGFP的PCR引物设计以pEGFP?N3为模板设计引物，上游引物:5′AAAgAATTCATggTgAgCAAgggCgAggAg3′，下划线为EcoRI酶切位点.下游引物:5′TTTCTCgAgTTACTTgTACAgCTCgTCCATg3′下划线为XhoI酶切点.

1.2.3EGFP的cDNA片段的扩增以pEGFP?N3为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL,分别加入引物、Taq酶、dNTP，10×Buffer等.扩增步骤如下:94℃变性5min,50℃退火45s,72℃延伸10min,循环28次,再94℃变性1min.PCR反应产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切后回收EGFP的cDNA片段备用.

1.2.4pET28a?TAT?EGFP与pET28a?EGFP重组质粒的构建将TAT双链片段经NheI，EcoRI双酶切后回收，与经同样酶切回收的Pet28a载体连接，构成pET28a?TAT重组质粒.重组质粒用EcoRI,XhoI双酶切消化,由T4DNA酶定向插入连接备用的EGFP片段，转化感受态细细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒，经酶切鉴定得到正确的重组融合表达载体pET28a?TAT?EGFP.同时参考以上方法构建对照质粒pET28a?EGFP.

1.2.5pET28a?TAT?EGFP在大肠杆菌中的表达及纯化质粒转化E.coliBL21,形成稳定的高表达细菌株.在含0.05g/L卡那霉素的LB平板上划单菌落，挑取单菌落至3mL的LB培养液中放大培养,细菌生长至对数期加1mmol/LIPTG诱导4～5h,收集细菌,PBS漂洗2次.超声裂菌，4℃,12000g离心15min，沉淀主要为包涵体,将包涵体溶于8mol/L尿素溶液中，在AKTAprime上用Ni?NTA?agarose亲和层析柱进行纯化，250mol/L的咪唑洗脱结合于柱上的蛋白，收集蛋白峰，用PBS透析后，纯化产物进行SDS?PAGE电泳分析.同样的方法得到蛋白EGFP.

1.2.6PC12细胞的培养及与蛋白作用培养基为DMEM，含100mL/L胎牛血清和50mL/L马血清，37℃，50mL/LCO2培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，接种细胞到60mm培养皿中，生长状态良好的细胞作为代表细胞株用于分析融合蛋白的跨膜递送作用.取纯化后的经PBS透析并无菌过滤的蛋白EGFP、融合蛋白EGFP?TAT，定量测量后，分别取50mg/L终浓度作用于PC12细胞表面15min后，PBS冲洗5次，荧光显微镜下拍照.

2结果

2.1重组质粒的酶切鉴定pET28a?TAT?EGFP与pET28a?EGFP经EcoRI,XhoI双酶切后的产物为720bp(图1)，与EGFP的PCR扩增产物一致.重组质粒双向测序完全正确,无PCR引起的突变(测序图略).原核表达载pET28a?TAT?EGFP与pET28a?EGFP构建成功.

2.2融合蛋白的表达及纯化阳性克隆子在IPTG诱导下表达出蛋白，在100mg/L的聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白电泳分析,相对分子质量(Mr)约在28000左右出现一条强表达带,符合预期分子质量大小（图2）.融合表达产物约占菌体总蛋白的20%.表达载体pET28a在多克隆位点之前含有一个6Histag，表达的蛋白N端融合了6Histag,便于融合蛋白通过Ni?NTA层析柱得到有效的纯化，蛋白纯度大于90%.

2.3融合蛋白进入细胞的检测TAT?EGFP融合蛋白加到含PC12细胞的培养基中,15min后在荧光显微镜下观察到细胞呈现出清晰明亮的绿色荧光(图3).而加入EGFP的对照组细胞则看到细胞周围较弱的荧光背景,细胞内无绿色荧光.同时观察到TAT的PTD区段能够有效地引导EGFP蛋白进入到视野中的绝大部分细胞.

3讨论

1988年，Green等［1］和Frankel等［2］各自独立地发现HIV?1病毒上的反式激活因子蛋白能够进入细胞膜，具有蛋白转导作用.Vives等［3］对TAT通过细胞膜的转导作用进行了研究，发现该蛋白分子中1个富含碱性氨基酸、带有较多正电荷的多肽片段（核心序列由11个氨基酸?YGRKKRRQRRR）与TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位有关，因而被称为蛋白转导结构域(proteinttransductiondomain,PTD).Schwarze等［4］将TAT与相对分子质量为（15～200）×103的蛋白进行融合后，可以介导这些蛋白从细胞外到细胞内的直接跨膜转运.Schwarze等研究发现TAT携带蛋白质能够通过血脑屏障,积累到一定浓度并表现出蛋白的活性.Sik等［5］报道了PTD?Tat与铜锌超氧化物歧化酶的融合蛋白跨膜进入胰岛β细胞达到治疗1型糖尿病的目的.此外已有研究证实，TAT除了向细胞内转运蛋白外，还可携带核苷酸、脂质体、甚至金属微粒进入几乎所有的组织和细胞，而且具有速度快，不依赖于温度、能量、细胞膜抗体，而且对细胞没有损伤等特点［6］，TAT被认为是一种很有前途的运载工具，但其详细机制目前还不是很清楚［7］.GFP来源于水母，与其他发光性报告分子不同,紫外线激发即可产生明亮、稳定的绿色荧光，但只有完整的GFP才能激发出绿色荧光［8］.GFP无种系依赖性,对宿主细胞无毒性,目前已作为一种新型的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域.我们所用pEGFP?N3载体中EGFP为一种突变型GFP,其mRNA翻译效率提高，所产生的荧光比野生型GFP增强35倍，更适用于检测各类细胞中EGFP融合蛋白的表达情况.PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，当用神经生长因子处理后，可分化成交感神经元样细胞，其在形态、生理、生化功能方面接近于神经元，因此PC12细胞广泛用于神经细胞死亡方式及神经毒理方面的研究.

我们采用pET28a原核表达系统,对TAT?EGFP进行了高效表达,目的蛋白约占细菌全部蛋白的20%.为使目的蛋白便于纯化，本研究选用pET28aHis·Tag作为纯化标记,将其放在蛋白的N?末端,表达的融合蛋白经亲和层析一步即可纯化,大大简化了蛋白的纯化步骤.纯化后得到的融合蛋白的浓度可达到200mg/L.纯化后的TAT?EGFP经SDS?PAGE电泳分析检测表明,表达的蛋白Mr在28000左右，符合预期大小，而且绿色荧光的检测说明EGFP蛋白的完整性及空间结构折叠的正确.TAT的PTD区段可将EGFP高效的导入PC12细胞内，为研究帕金森病、脑血管病等多种神经系统疾病的蛋白传送提供了一个很好的研究工具.由于进入细胞后的蛋白可以表现出活性,故对于蛋白功能研究也是一个比较好的手段.