几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探

摘要：从采自全国的200多份土样中分离出1350多株菌，利用平板透明圈法和铁氰化钾方法，以家蚕中肠几丁质酶作为靶标，从这些菌株中筛选出家蚕几丁质酶抑制化合物的产生菌1237#，经初步鉴定该菌株为假单胞菌。本文主要介绍几丁质酶抑制化合物筛选体系的建立、活性物质性质的初步探索及目的菌株的鉴定。

关键词：几丁质酶;抑制化合物;产生菌

几丁质是甲壳类动物、昆虫外骨骼和真菌细胞壁的重要组成成分，它是N乙酰葡萄糖胺以β1，4键连接起来的直链多聚物。几丁质在自然界中的存在量仅次于纤维素位居第二。几丁质酶是一类能把几丁质降解为N乙酰胺基葡萄糖或寡聚N乙酰胺基葡萄糖的水解酶。真菌需要几丁质酶降解子母细胞之间的隔以完成其生殖过程;昆虫发育过程中也需要几丁质酶部分降解外骨骼以完成其变态发育的过程，因此在真菌生殖阶段和昆虫蜕皮阶段其体内几丁质酶的活性显著增高。由于几丁质酶在真菌出芽生殖和昆虫蜕皮过程中发挥了极为重要的作用，这就使得几丁质酶可能成为生物杀虫剂和抗真菌药物专一性作用的靶目标。同时由于哺乳动物不以几丁质代谢作为生命活动必需系统[1]，故以几丁质酶作为靶目标的生物杀虫剂和抗真菌药物具有对人畜无害的优点。至今已报道的几丁质酶抑制剂主要有：Allosamidin[2]、Argifin[3]、Argadin[3]、Demetyallosamidin[4]等。长期以来日本等国一直在进行几丁质酶抑制化合物的研究，但国内至今未见与几丁质酶抑制化合物相关的研究报告。本研究旨在从我国丰富的微生物资源中获得具有自主知识产权的新型几丁质酶抑制化合物及其生产菌株，为开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物奠定基础。

1材料与方法

1.1培养基

1.1.1平板培养基PDA培养基。

1.1.2液体培养基(%)葡萄糖1，蛋白胨02，牛肉膏01，酵母提取物01，Fe2(SO4)30001，pH72。

1.1.3几丁质酶抑制化合物的筛选平板(%)MgSO4005，KH2PO4005，KCl005，FeSO4・7H2O001，ZnSO4・7H2O01，胶体几丁质1，琼脂粉12，pH72。

1.2几丁质酶粗酶提取家蚕初蛹中肠液，经硫酸铵盐析、透析后冻干保存备用;几丁质由日本信州大学下板诚教授赠送;胶体几丁质：利用盐酸处理几丁质制备[5]。

1.3活性菌株的液体培养方法菌体接种于液体培养基，37℃振荡培养6d，培养液8000r/min离心10min，取上清检测活性。

1.4几丁质酶抑制物的检测方法

1.4.1平板透明圈法将几丁质粗酶配成01g/ml的几丁质粗酶液(以后提到的酶液均是按此法配成)，把酶液与筛选菌株培养液按1∶2的比例混合，在几丁质酶抑制化合物筛选平板上打孔，取混合液50μl加样于孔中，观察平板透明圈的大小。在检测过程中以蒸馏水、缓冲液和液体培养基作为空白对照。几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和无机盐。在平板上打孔加入酶液，几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与检测液混合时，透明圈变小表明酶的活性受到抑制，透明圈越小表明受抑制的程度越高。这种方法能够直观、快捷地筛选出几丁质酶抑制化合物。

1.4.2铁氰化钾方法[7]500μl胶体几丁质加入100μl酶液、不同测试培养液或对照液和pH72磷酸盐缓冲液(测试液体与缓冲液总体积为1000μl)，37℃反应30min，加入2ml糖显色液，沸水浴15min终止反应，离心，冷却后测上清的A420(糖显色液用05mol/L的Na2CO3配制成137μmol/L的铁氰化钾溶液)。测试组1500μl胶体几丁质加入100μl酶液和1000μlpH72磷酸盐缓冲液，在37℃进行正常酶促反应30min后进行测定。对照1(C1)500μl胶体几丁质加入100μl酶液和1000μlpH72磷酸盐缓冲液，加样后立即沸水浴15min灭活酶，再置于37℃保温30min和其他组一起测定。测试组2500μl胶体几丁质加入100μl酶液、100μl培养液和900μlpH72磷酸盐缓冲液，在37℃进行正常酶促反应30min后进行测定。对照2(C2)500μl胶体几丁质加入100μl酶液、100μl培养液和900μlpH72磷酸盐缓冲液，加样后立即灭活，再置于37℃保温30min和其他组一起测定。测试组1与对照组1的吸光值的差值为ΔAbs1，测试组2与对照组2的差值为ΔAbs2。测定后按以下公式计算几丁质酶活性：酶活性(U/ml)=ΔAbs×1000×1000215.61×反应时间(min)×反应体系中酶液的体积(μl)

1.51237#菌株产生的几丁质酶抑制化合物理化性质初步探索

1.5.1活性培养液的耐热性检测耐热性实验中设计了100℃、90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃等7个温度梯度，均处理30min以后用平板透明圈法检测其对几丁质酶的抑制活性。

1.5.2几丁质酶抑制化合物的浸取或萃取用甲醇、乙醇和水浸提等量1237#发酵液冻干粉中的几丁质酶抑制活性成分;用氯仿、乙酸乙酯萃取等体积的1237#发酵液中的几丁质酶抑制活性成分。

1.5.3有机溶剂沉淀几丁质酶抑制化合物用丙酮、无水乙醇进行活性发酵液的有机溶剂沉淀。

1.5.41237#具几丁质酶抑制活性的发酵液对α淀粉酶活性的影响使用平板透明圈法，用以淀粉和无机盐作为基质的检测平板，检测具几丁质酶抑制活性的1237#菌株发酵液对α淀粉酶活性的影响。

1.6几丁质酶抑制物产生菌的菌种鉴定[7]参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》进行菌种鉴定。

2结果

2.1利用平板透明圈法初步筛选出几丁质酶抑制物产生菌由于平板透明圈法筛选几丁质酶抑制物快捷、直观，所以在粗筛的过程中采用此法。本研究从土壤中分离出的1000多株菌中筛选出菌株1237#，其代谢产物对家蚕几丁质酶具有很强的抑制活性(图略)。

2.2化学方法进一步验证1237#对家蚕几丁质酶的抑制作用在利用平板透明圈法初步确定了假单胞菌1237#代谢产物对家蚕几丁质酶活性的抑制作用的基础上，我们利用化学方法进一步确定了该菌次级代谢产物对家蚕几丁质酶的抑制活性。进行三次重复，其ΔAbs如图1所示。从几丁质酶活力的计算公式中，我们可以看出，在其它条件都不变的情况下，酶活性的强弱取决于ΔAbs的大小。分析几组数据，得出在加入1237#菌株的培养液后，家蚕几丁质酶的活性被抑制了513%。化学方法进一步确定了该菌株次级代谢产物中含有对几丁质酶活性具有抑制作用的物质。1：正常情况下的ΔAbs;2：加入具几丁质酶抑制活性的发酵液后的ΔAbs图1假单胞菌123#次级代谢产物对家蚕几丁质酶的抑制作用

2.3几丁质酶抑制化合物理化性质的初步探索

2.3.1几丁质酶抑制化合物的耐热性研究表明菌株1237#产生的几丁质酶抑制物耐热性较差，在60℃处理30min将完全丧失几丁质酶抑制活性;50℃处理30min也使几丁质酶抑制活性部分丧失;但在40℃以下保温数天对几丁质酶抑制活性无影响。

2.3.2几丁质酶抑制化合物的浸提或萃取用甲醇、乙醇和水来浸提等量的活性发酵液冻干样品中的几丁质酶抑制活性组分时，仅仅只有水能将冻干样品中的几丁质酶抑制活性组分溶解提出，甲醇和乙醇不能将其浸提出;若将甲醇和乙醇浸提后的不溶物用水溶解后检测其具有几丁质酶抑制活性。用氯仿进行液液萃取时，萃取结束后水相和氯仿中均检测不出几丁质酶抑制活性，提示活性物质被破坏;用乙酸乙酯进行萃取，活性物质仍留在水相中。

2.3.3有机溶剂沉淀丙酮和无水乙醇均能将1237#菌株次级代谢产物中的几丁质酶抑制活性成分沉淀出，但使用相同体积的有机溶剂时，丙酮沉淀得到的活性物质的量更多。

2.3.41237#具几丁质酶抑制活性的发酵液对α淀粉酶活性的影响该实验结果显示，1237#菌株代谢产物对α淀粉酶的活性不会产生任何影响，这在一定程度上说明1237#菌株代谢产物中含有几丁质酶的特异性抑制化合物。

2.4几丁质酶抑制物产生菌的分离、纯化、鉴定从全国采集的300多份土样中分离出1000多株菌，这些菌主要是细菌和真菌。从这批菌种中我们筛选到几丁质酶抑制物的产生菌1237#，根据其菌落形态和菌体形态，参照伯杰氏细菌鉴定守则鉴定该菌株为假单胞菌，部分性质见表1。表11237#菌株部分性质检测项目结果检测项目结果革兰染色阴性直径/长0.5μm/2μm氧化酶反应阳性明胶水解反应阳性接触酶反应阳性生长温度影响最适温度：37℃;4℃不生长，41℃能生长

3小结

本研究在建立简便、快速几丁质酶抑制化合物的检测方法(平板透明圈法)的基础上，从土壤中筛选到假单孢菌1237#。该菌株的次级代谢产物中含有几丁质酶抑制化合物。在对该几丁质酶抑制化合物性质初步探索的过程中发现该物质不能耐受较高温度，60℃处理30min丧失几丁质酶抑制活性;活性物质是极性很强的水溶性化合物，乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯均不能将其萃取出来，同时氯仿对几丁质酶抑制化合物的活性具有极大的破坏作用，用氯仿萃取活性将完全丧失。从以上的研究结果可以初步推断假单胞菌1237#次级代谢产物中的几丁质酶抑制化合物可能是蛋白质或者肽类物质。此外，该几丁质酶抑制活性物质不会对α淀粉酶的活性产生任何影响。关于该物质的纯化和其相关基因的克隆工作尚在进行中。