牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的双向调节作用

【摘要】目的：从牛大力(MillettiaSpeciosaChamp.)提取纯化多糖，流式细胞术检测多糖对刀豆蛋白A(ConA)刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响，探讨牛大力多糖对免疫系统的调节作用机制，为临床用牛大力治疗多种慢性疾病提供理论和实验依据。方法：提取、纯化牛大力多糖，利用CFDA-SE染色,流式细胞术检测多糖对ConA刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响。结果：终浓度为160μg/mL、800μg/mL、4mg/mL、20mg/mL的多糖对小鼠T淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制,而终浓度为5、25、50、125μg/mL的多糖对小鼠T淋巴细胞增殖起促进作用,剂量依赖关系不明显。结论：牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞的增殖呈双向调节作用。

【关键词】牛大力;多糖;T淋巴细胞;CFDA-SE

牛大力(MillettiaSpeciosaChamp.)又叫山莲藕、大力薯，豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(MillettiaspeciosaChamp.)的干燥根[1]，主产于广东东部。牛大力用药始载于《生草药性备要》[2]，历史悠久，性味甘、平，具有补虚润肺、强筋活络的功用，临床主要用来治疗肺热咳嗽、风湿性关节炎、腰肌劳损、胃溃疡、慢性肝炎、肺结核等疾病[1]。早在20世纪70年代，牛大力作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊的原料已用于中成药的生产[3]。目前，对牛大力免疫活性的研究有过报道[4]，但对其多糖药理活性尚未见报道。本文提取、分离、纯化牛大力多糖，鉴定多糖主要的理化性质，并利用CFDA-SE染色、流式细胞术研究多糖对刀豆蛋白A(ConA)引起的T淋巴细胞增殖的影响,为阐明其对免疫系统的影响及临床治疗多种疾病提供理论和实验依据，为牛大力的进一步开发利用提供科学依据。

1材料

1.1动物

雄性SPF级Balb/c小鼠,4～5周龄,体质量(12±2)g,由中山大学动物所提供(合格证号00A005)。

1.2试药与仪器

牛大力购自广州天河石牌东百康源大药房，经鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(MillettiaSpeciosaChamp.)的根;Vy-brantTMCFDA-SECellTracerKit(c-1288)购自美国MolecularProbes公司;ConA、RPMI-1640、胎牛血清、L-谷氨酰胺、β-二巯基乙醇均购自美国Sigma公司;FAC-SCalibur流式细胞仪,为美国BectonDickinson公司产品;旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂。

2方法与结果

2.1牛大力多糖的理化性质测定

2.1.1牛大力多糖的提取和纯化

称取新鲜干燥的牛大力切片800g，粉碎，用6倍量的水，加热到90℃煮1h，过滤，再加5倍量的水,煮1h后过滤，再重复1次，合并3次的滤液，旋转蒸发浓缩，向浓缩液中加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到80%，析出大量白色絮状沉淀，4～8℃放置过夜后抽滤。再用适量的水溶解，加入总体积25%的Sevage试剂(三氯甲烷∶戊醇=5∶1)，振摇后形成胶状物，离心除去析出物和乳化层的蛋白，重复2次操作除尽蛋白。浓缩上清液，装入分子量范围为8000～10000的透析袋中于流动的蒸馏水中透析过夜，将透析袋中溶液取出，浓缩后再加入无水乙醇至乙醇的浓度达到80%，4～8℃放置过夜后抽滤。将沉淀依次用丙酮、甲醇洗涤脱色，50℃烘干即得到牛大力多糖[5]。

2.1.2多糖的含量测定

参照文献[6，7]，采用蒽酮-硫酸法检测粗品中糖含量，与标准曲线对比，得到线性回归方程y=0.0047x-0.0003，计算得到牛大力多糖的糖含量为96.3%。如图1所示。

2.2牛大力多糖对ConA刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响

2.2.1淋巴细胞悬液的制备

将Balb/c小鼠断髓处死，无菌取小鼠颈部、腋下、腹股沟以及肠系膜的淋巴结,去掉被膜，200目筛网研磨过滤，收集细胞,用PBS离心(180×g,10min)洗涤细胞2次,PBS重悬。

2.2.2淋巴细胞CFDA-SE染色CFDA-SE用DMSO溶解成10mmol/L的储存液,-20℃保存,临用前,取适量用PBS稀释成1mmol/L的工作液,平衡至室温备用。调整淋巴细胞悬液的密度为107cells/mL,细胞悬液按10000∶1(体积比)加入CFDA-SE工作液后,在室温条件下避光充分混匀10min,然后用RPMI-1640完全培养液(含体积分数10%FBS)离心(180×g,10min)洗涤细胞2次,并调整细胞浓度为2×106cells/mL。

2.2.3多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

将上述经CFDA-SE标记的淋巴细胞接种于96孔细胞培养板,分别设置空白对照组,ConA组,ConA+多糖溶液实验组。实验组中多糖终浓度分别5、25、50、125、160、800μg/mL，4、20mg/mL,定容至200μL/孔,上述各实验组ConA的浓度均为5μg/mL。在37℃,5%CO2温箱培养48h后对CFSE荧光强度(FL1)进行检测。

2.2.4流式细胞仪检测、分析及数据统计

羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)是一种染色细胞结构蛋白的荧光染料。本文采用的CFDA-SE标记技术就是利用CFDA-SE随细胞每增殖一代,荧光强度的系列减半特征,结合流式细胞术,动态追踪分析细胞增殖的技术,计算出增殖指数(proliferationindex,PI),即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值),研究T细胞的增殖[8,9]。

从FAC-SCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取数据。在前散射(FSC)和对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R,分别对每个组别的这群细胞的FL1强度进行检测。每管样品检测10000个细胞，获得的数据用CELLQuest软件分析。统计方法用t检验,数据以均值±标准差(x±s)表示。

培养48h后,空白对照组经流式细胞仪检测，结果显示细胞绝大部分处于亲代峰,PI分别为1.01，1.00,表明T淋巴细胞没有增殖(见图2A、3A)。而ConA组，T淋巴细胞除了亲代峰,还出现了子代峰(见图2B、3B),表明ConA刺激48h后，T淋巴细胞增殖显著。与对照组相比，子代细胞荧光强度减半。

加入牛大力多糖作用48h后,浓度为5、25、50、125μg/mL的多糖均对ConA刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖起促进作用，这些实验组的PI值均高于对应的ConA刺激组，但不呈剂量依赖关系(见图2C～2F)。而浓度为160μg/mL、800μg/mL、4mg/mL、20mg/mL的多糖实验组均对ConA刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖起抑制作用,PI值均明显低于ConA刺激组，并且呈剂量依赖性抑制(见图3C～3F)。其中终浓度为160μg/mL、800μg/mL、4mg/mL多糖实验组显示亲代峰和子一代、子二代峰(见图3C～3E)。而终浓度为20mg/mL,只显示一个亲代峰和一个微弱的子一代峰，PI值为1.03，接近完全抑制了ConA刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖作用(见图3F)。

综上所述，牛大力多糖在终浓度为5、25、50、125μg/mL剂量时，对小鼠T淋巴细胞增殖起促进作用，但剂量依赖关系不明显，在终浓度为160μg/mL、800μg/mL、4mg/mL、20mg/mL剂量时,对小鼠T淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制。

3讨论

本实验采用ConA刺激T细胞增殖以及牛大力多糖对ConA刺激引起T细胞增殖抑制或促进作用,均能以CFSE荧光强度的改变表现出来。通过CELLQuest软件拟合，得到增殖指数，实现牛大力多糖对T细胞增殖影响的可视化及数量化、定量化，与传统检测细胞增殖的方法相比，该方法具有操作简单、使用方便、安全无辐射、观察期长等诸多优点，具有卓越的优越性。

本研究发现牛大力多糖是牛大力调节免疫功能的主要活性成分之一。牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖具有双向调节作用。T细胞是整个免疫应答反应的关键细胞之一,干预T淋巴细胞的行为能有效地调控机体的免疫应答反应。这为探讨牛大力具有抗炎和免疫增强等临床效应提供了线索。研究认为肝炎等炎症都直接或间接地与淋巴细胞活化与增殖相关。慢性肝炎的发病机制与辅助性T细胞(Th)等细胞免疫功能密切相关[10]。由于高浓度的牛大力多糖能抑制T淋巴细胞的增殖，且具有明显的剂量依赖性效应。牛大力可能通过多糖来抑制T淋巴细胞的增殖,从而抑制Th细胞的功能来调节细胞免疫。这或许是牛大力有效治疗这些疾病的原因之一。报道的牛大力治疗慢性肝炎的中医药方里,牛大力用量达到最多[1]。高剂量的牛大力药方可能是为了形成一个较高浓度的多糖溶液。另外，牛大力具有补虚润肺、强筋活络、壮身健体的功用，能增强机体的免疫力与抗病能力[8],而低浓度的牛大力多糖能促进T淋巴细胞的增殖。因此推测,牛大力可能通过多糖来促进T淋巴细胞的增殖，从而增强机体的免疫力。但本实验发现低浓度牛大力多糖对T细胞的促进效应不具有明显的剂量依赖关系。

本研究为牛大力对免疫应答的调节作用、对炎症的抑制作用及免疫增强等药理活性提供一定的实验依据，也为临床上使用牛大力治疗肝炎等多种疾病提供了科学依据，加深了对牛大力多糖药理作用的认识，有利于合理、科学、有效地使用牛大力治疗疾病。目前，以植物药为主的传统中药在调节机体免疫方面有着特殊的优势,且副作用相对较小。因此，牛大力用来治疗慢性肝炎等疾病具有广阔的前景。牛大力多糖的具体免疫调控机制还有待于进一步的研究。