孤啡肽对DGP胃动力的影响

【摘要】目的：探讨糖尿病胃轻瘫（DGP）大鼠血浆孤啡肽（OFQ）的变化与胃轻瘫的关系及意义.研究孤啡肽对DGP胃排空的作用.方法:SPF级雄性Wistar大鼠90只随机分为正常对照组(n=15)和实验组(n=75).正常对照组以普通饲料喂养20wk，实验组以高脂高糖饲料喂养6wk后小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射加高糖高脂饲料及饮食失节法继续诱导20wk，建立糖尿病模型.应用放射性核素胃排空法筛检出DGP及糖尿病(DM)大鼠模型.采用酶联免疫法测定空腹血浆OFQ，而后将DGP再随机分为3组,分别给予OFQ0.6,6.0,60.0nmol/kg静脉注射，每日1次,连续5d,再次测定胃排空.结果：正常对照组、DM组及DGP组胃半排空时间(GET1/2)分别为(61.9±4.6),(66.5±2.3),(168.9±10.6)min,DGP组GET1/2较正常对照组、DM组显著延迟,差异有统计学意义(P<0.05).DGP组血浆OFQ较正常对照组、DM组显著降低，差异有统计学意义［(5.30±1.70)ng/Lvs(9.83±5.70),(8.90±3.50)ng/L,P<0.05］.相关性分析显示,血浆OFQ水平与胃轻瘫之间呈负相关关系(r=-0.6726,P=0.004).DGP大鼠静脉注射OFQ0.6,6.0,60.0nmol/kg后胃半排时间较前有明显缩短［(136±7)vs(166±8)min,(101±12)vs(162±11)min,(112±10)vs(158±12)min，P<0.05］，治疗前后差异有统计学意义(P<0.05)，其中6.0nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果，增加OFQ剂量并不能相应提高其治疗效果.结论：OFQ在DGP中起着重要的调节作用，与DGP胃半排时间呈负相关.静脉注射OFQ可以明显缩短DGP大鼠的GET1/2，其中6.0nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果.

【关键词】孤啡肽；糖尿病并发症；胃肌轻瘫；胃排空；大鼠

0引言

糖尿病性胃轻瘫（diabeticgastroparesis，DGP)以胃肠动力不足为主要特征.目前临床治疗主要应用促进胃肠动力的药物缓解症状，疗效欠佳.孤啡肽(OrphaninFQ,OFQ)或痛敏素(nociceptin)是一种具有拮抗吗啡镇痛作用的内源性阿片肽类物质.有研究认为OFQ是一种胃肠道内的活性肽类物质和胃肠功能的内源性神经调节剂［1］.对于OFQ的研究目前主要集中在减轻疼痛和其他生理活动中的作用，其胃肠功能调节的生物学效应尚未完全阐明.研究DGP大鼠血浆OFQ的变化、OFQ对DGP大鼠胃排空的作用、以及OFQ剂量与胃排空的关系，将有助于拓宽胃肠动力紊乱的治疗思路.

1材料和方法

1.1材料SPF级雄性Wistar大鼠90只,体质量(225±15)g，由甘肃中医学院SPF动物实验中心提供；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；血糖测定仪及试纸由强生公司提供；OFQELISA试剂盒为美国ADL公司的产品;MK?2酶标仪JZW?I?20；OFQ由兰州大学生命科学学院人体与动物机能实验室提供；同位素99mTc2二亚乙三胺五醋酸(DTPA)由中国医学科学院同位素研究所提供；以色列ElscintHelix公司的双探头单光子发射计算机断层照相仪.

1.2方法

1.2.1动物分组与实验处理随机选取15只大鼠作为正常对照组，该组以普通饲料喂养.另75只为实验组大鼠,以高脂高糖饲料（100g/L猪油、200g/L白糖﹑25g/L胆固醇，10g/L胆酸盐﹑665g/L常规饲料）饲养，两组诱导6wk后正常对照组经腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液，实验组经腹腔注射枸橼酸缓冲液配制的链脲佐菌素（STZ）(30mg/kg).72h后尾静脉采血测定空腹血糖，以空腹血糖高于16.7mmol/L确定为糖尿病模型建立成功.有65只达标，8只不达标，造模过程中死亡2只.3d后补注STZ（15mg/kg,ip），测定血糖2只达标，6只不达标剔除实验.67只糖尿病大鼠造模成功后，不用胰岛素和任何降糖药物控制血糖.以高脂高糖饲料以及饮食失节法继续饲养20wk，每周检测血糖和体质量，20wk后应用放射性核素胃排空法，以正常对照组为正常范围［2］，筛检出DGP大鼠53只，将胃排空功能正常的大鼠设为糖尿病组（n=14）.随机选取DGP大鼠（n=16）心脏采血,分离血浆,置-80℃超低温冰箱保存，待测.剩余37DGP只大鼠，其中3只于尾静脉注射过程中在固定器内窒息死亡，剩余34只再随机分为3组,分别给予OFQ0.6（n=10),6.0(n=12).60.0nmol/kg(n=12)尾静脉注射,连续5d，每日1次,第5日注射后再次进行胃排空、体质量及血糖测定.

1.2.2核素胃排空功能测定采用同位素闪烁计数法(APEXSP26,ElscintInc公司)检测胃排空功能.大鼠禁食12h、禁水6h后，应用含有同位素99mTc2DTPA标记的蒙牛纯牛奶大鼠腹部为目标区（窗宽20％，矩阵128×128，放大倍数3.0），行放射性活性1.5mL(99MTc?DTPA0.5mCi)，通过灌胃器缓慢注入胃内.之后立即将大鼠仰卧绑缚于特制固定架上，以采集.前半小时每5min采集1次，然后每15min采集1次，共采集11次，连续测定90min.通过随机软件，计算出各项指标的校正值及胃的排空曲线.

1.2.3酶联免疫法测定血浆OFQ大鼠空腹12h（禁食不禁水）后在吸入乙醚麻醉后对各组进行心脏采血，血液置入预冷的含抑肽酶(500IU/L)和乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2，10g/L)的塑料指型管中，充分混匀后，4℃，3000r/min，离心10min，留取血浆-80℃保存，统一采用ELISA方法测定孤啡肽，各步骤严格按照说明书操作.

统计学处理：各组指标用x±s表示,组间差异用方差分析,以P<0.05为有统计学意义.用Pearson直线相关法进行相关分析,P<0.05为有统计学意义.应用SPSS11.5软件进行数据处理，Sigmaplot10.0软件作图.

2结果

2.1大鼠体质量正常对照组大鼠体质量在实验期间由(223±16)g增至(420±18)g，实验组大鼠初始体质量为(221±29)g,与正常对照组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05，图1）.造模前6wk实验组大鼠体质量增长迅速，经STZ诱导为糖尿病模型20wk后,实验组大鼠体质量较成模前明显下降(P<0.05).协方差分析表明，DGP大鼠体质量［(300.0±23.2)g］较正常对照组、DM组明显下降，正常对照组大鼠体质量的增长显著高于DM组和DGP组(P<0.05).给予OFQ治疗后3种剂量组大鼠的体质量前后比较差异无统计学意义(P>0.05).

2.2大鼠血糖正常对照组大鼠的初始血糖为(5.7±0.6)mmol/L,20wk后为(7.1±0.5)mmol/L，前后差异无统计学意义(P>0.05).DM,DGP大鼠在腹腔注射STZ72h后其空腹血糖水平［(23.5±5.2),(22.9±4.3)mmol/L］较正常对照组大鼠显著增高，差异有统计学意义(P<0.05).DM,DGP组大鼠血糖变化在随后的20wk无统计学意义,DGP各组给予OFQ治疗后前后血糖变化无统计学意义(P>0.05).

2.3胃半排空时间、胃内核素残留率正常对照组大鼠胃半排空时间(GET1/2)为(61.9±4.6)min，90min后胃内核素残留率为(46.4±3.6)%.以正常对照组为正常范围,筛检出DGP大鼠,DGP组大鼠GET1/2为(168.9±10.6)min,90min后胃内核素残留率为(85.6±2.9)%,均显著延迟或高于正常对照组和DM组,差异有统计学意义(P<0.05).DM组大鼠GET1/2为(69.6±3.0)min,90min后胃内核素残留率为(50.9±4.1)%,与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）.

DGP：糖尿病胃轻瘫；DM：糖尿病.

图13组大鼠体质量的变化（略）

2.4血浆OFQ含量与胃半排空时间相关性分析正常对照组大鼠血浆OFQ与DM组比较差异无统计学意义［(9.83士5.70)vs(8.90士3.50)ng/L,P>0.05)］.DGP组大鼠血浆OFQ［(5.30士1.70)ng/L］与DM组、正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),血浆OFQ含量与GET1/2有负相关关系(r=-0.6726，P=0.004，图2）.

图2血浆孤啡肽与胃半排空时间相关性（略）

2.5DGP大鼠在OFQ治疗前后的胃半排空时间3组DGP大鼠给药后GET1/2都较本组治疗前显著缩短,前后比较差异有统计学意义(P<0.05，表1）.方差分析表明，6.0,60.0nmol/kg组大鼠的GET1/2在给药后与0.6nmol/kg组比较差异有统计学意义(P<0.05).6.0,60.0nmol/kg组大鼠的GET1/2在给药后比较差异无统计学意义(P>0.05).

表13种剂量孤啡肽治疗糖尿病胃轻瘫大鼠胃半排空时间的比较（略）

aP<0.05vs0.6nmol/kg组；cP<0.05vs给药前

3讨论

DGP的胃肠动力障碍，不仅影响患者食物的吸收和消化,还因影响口服药物的吸收而给糖尿病的治疗带来极大的干扰.目前认为可能是自主神经功能障碍、胃肠激素分泌异常、高血糖、平滑肌损害以及微血管病变等因素综合影响的结果.OFQ是一种新近发现的内阿片肽,与经典的阿片肽一样属于脑肠肽，作为一种胃肠道内的活性肽类物质，它是一种新的胃肠功能的神经调节剂［1］.许多学者证实OFQ与经典的阿片肽一样定位于大鼠的肠神经系统，属于肠神经系统的神经递质，参与肠神经系统对胃肠动力、内分泌、粘膜血流及免疫功能的调节［3］.相对于胃肠道来讲，肠神经系统的作用要大于中枢神经系统.OFQ作为重要的脑肠肽之一,高度表达于胃肠神经系统而非平滑肌上［4］.Krowicki等［5-6］发现静脉注入0.6～60.0nmol/kgOFQ可提高大鼠胃的收缩活性，提高胃内压.有研究检测了健康人、肝硬化到肝癌患者的血浆OFQ水平,证实呈梯度升高趋势，可为临床诊治肝脏肿瘤提供旁证［7］.另外血浆OFQ在肝豆状核变性病［8］、慢性胆囊炎、慢性胃炎及十二指肠球部溃疡中皆升高，在急性胰腺炎呈现进行性升高［9］.而在糖尿病胃动力障碍的长期慢性状态下血浆OFQ水平的变化目前尚未见研究.本研究采用ELISA方法测定血浆OFQ水平，发现DGP组明显低于正常对照组和DM组,提示血浆OFQ水平在DGP时明显下降.以上的结果说明可能由于长期糖尿病造成了微血管、胃肠肌间神经和肠神经系统神经细胞变性，导致肽能神经受损［10］.使得定位于大鼠肠神经系统的内源性肠神经递质之一的OFQ减少，由于DGP大鼠体内缺乏促进胃肠动力的内源性神经肽OFQ,导致OFQ促进胃肠动力的作用减弱，从而引起DGP大鼠出现一系列胃肠动力障碍的胃肠道症状.并且随着血浆OFQ含量呈现下降趋势，GET1/2的延迟时间呈现延长趋势，相关性分析显示血浆OFQ水平与GET1/2呈显著负相关,提示血浆OFQ的含量越下降，胃排空延迟时间越长，说明OFQ在DGP的发病中起着重要的调节作用.本研究静脉给予0.6，6.0，60.0nmol/kg3种剂量OFQ对DGP大鼠再次测定胃排空，作前后比较治疗效果有统计学意义，说明OFQ是具有促进胃肠动力作用的内源性神经肽.其中6.0nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果,说明增加OFQ剂量并不能相应增加其治疗效果，与上述研究结果一致［5-6］.故认为OFQ含量的减少可能是DGP胃动力减弱的因素之一，进一步研究OFQ与胃肠动力障碍的发病机制将有助于拓宽胃肠动力紊乱的治疗思路.