胶质瘤中NDRG2，PKC?α mRNA表达及相关性

【摘要】目的：研究胶质瘤中蛋白激酶PKC?αmRNA表达与NDRG2mRNA表达的相关性，寻找可能与NDRG2相互作用的上下游分子.方法：用实时定量PCR技术检测26例脑胶质瘤及相应瘤旁组织中NDRG2和PKC?αmRNA表达量.结果：26例脑胶质瘤NDRG2mRNA表达低于瘤旁组织(0.95±0.16vs1.54±0.18,P<0.05)，PKC?αmRNA表达高于瘤旁组织(1.23±0.11vs0.97±0.18，P<0.05)，且随胶质瘤恶性程度增高，NDRG2表达逐渐减少(P<0.05)，PKC?α表达有逐渐增加的趋势.NDRG2与PKC?α表达无相关(P>0.05).结论：NDRG2，PKC?α可能与胶质瘤的发生发展及恶性演变有关，在mRNA表达水平，还不能认为NDRG2与PKC?α之间有相关性.

【关键词】神经胶质瘤;NDRG2基因;蛋白激酶C?α;实时定量PCR

0引言

人的N?myc下游调节基因(humanN?mycdownstreamregulategene，hNDRG)分为以下几个亚型：NDRG1，NDRG2，NDRG3，NDRG4.NDRG2是我们于1999年用改良消减杂交法从人脑内克隆的一个新的抑癌候选基因[1]，位于染色体14q11.2.近年来对NDRG2的研究表明，它在多种正常组织中广泛高表达，但在肺癌、甲状腺癌等多种肿瘤中低表达或不表达，且转染肿瘤细胞时，对细胞有生长抑制作用[2-3].因此目前认为NDRG2可能是一种与肿瘤发生发展有关的抑癌基因，深入探讨NDRG2抑制肿瘤生长的机制有重要的意义.随着对肿瘤研究的深入，细胞信号转导在肿瘤发生发展中的作用受到越来越多的重视.蛋白激酶C(proteinkinase，PKC)是细胞信号传递的关键分子之一，根据其发生作用时协同因子的不同，分为3组共12种同功酶亚型，每种亚型在激活方式、底物特异性及在组织细胞内的分布均有差异，提示其生物学效应不同[4].PKC?α为PKC亚型中钙依赖型或经典型组成之一，目前研究认为PKC?α在一些肿瘤组织中高表达，且能促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞的分化和凋亡[5].本实验采用实时定量PCR技术检测脑胶质瘤及相应瘤旁组织中NDRG2与PKC?αmRNA表达量，寻找与NDRG2表达相关的信号转导通路.

1材料和方法

1.1材料26例胶质瘤及瘤旁组织标本来源于2006?11/2007?09第四军医大学西京医院和唐都医院神经外科手术治疗的脑胶质瘤患者，男14例，女12例，年龄13～70岁，平均41岁.其中星形胶质细胞瘤12例，多形性胶质母细胞瘤6例，间变型星形细胞瘤3例，少突胶质细胞瘤4例，室管膜瘤1例，按WHO中枢神经系统恶性肿瘤病理分级标准，将胶质瘤分为Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级，分别为10，8，8例，所有标本均经神经病理确诊，液氮冷冻后，置-70℃冰箱保存备用.Trizol购自Invitrogen公司，RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKits购自Fermentas公司，SYBR(R)PremixExTaqTM试剂盒为大连宝生物公司产品，引物由北京奥科生物工程有限公司合成.主要仪器有美国Beckman公司生产的紫外分光光度仪，美国ABI7500RealTimePCRSystem.

1.2方法

1.2.1组织提取总RNA取50～100mg组织标本置于灭菌匀浆器中，加入1mL预冷的Trizol，在冰上充分研磨，然后将液体移入1.5mL离心管，4℃，12000g离心15min,取上清，加入1/5体积氯仿，充分混匀，室温静置5min，4℃，12000g离心15min.将上层液体小心移至新的l.5mL离心管中，加等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，4℃12000g离心15min，弃上清.加1mL750mL/L乙醇，充分混匀，4℃，12000g离心10min.弃上清，室温干燥5min，见管底有白色沉淀，即为所得总RNA.将所得RNA溶解于适量DEPC处理水中.紫外分光光度仪测定纯度及含量，A260nm/A280nm比值在1.8～2.0之间.

1.2.2cDNA模板的制备根据Fermentas反转录试剂盒说明，将2mg总RNA反转录为cDNA，-20℃冰箱保存备用.

1.2.3实时定量PCR分析引物设计：NDRG2(GenBank检索号：AF159092)上游5′?GAGAT?ATGCTCTTAACCACCCG?3′，下游5′?GCTGCCCAATCCATCCAA?3′;扩增片段90bp;PKC?α(GenBank检索号：NM002737)上游：5′?TGTAGAGGCCATTCAACCGTCA?3′,下游：5′?AAGCGTATCATGCAAACGGAGATTA?3′，扩增片段125bp;管家基因b?actin(GenBank检索号：NM001101)上游5′?ATCATGTTTGAGACCTTCAACA?3′，下游5′?CATCTCTTGC?TCGAAGTCCA?3′，扩增片段318bp.PCR反应体系25mL，包括SYBRGreenⅠ12.5mL，ROXⅡ0.5mL,10mmol/L的上下游引物各0.5mL，cDNA模板0.5mL，补充灭菌ddH2O至25mL.RealTimePCR反应条件：95℃预变性10s后，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，共40个循环.加样时，按照ABI7500RealTime仪器说明书，每一样本和基因同时做一个相同的复孔，输出数据为两者的平均值，统计时采用目的基因与管家基因的比值即相对定量值(relativequantitation,RQ)进行比较.

统计学处理：数据采用x±s表示，使用SPSS11.0统汁学软件处理.胶质瘤与瘤旁组织比较用配对t检验，多个样本均数比较用方差分析及LSD?t检验，两指标间相关分析用Pearson相关法，P<0.05时认为有统计学意义.

2结果

2.1胶质瘤中NDRG2mRNA的表达分析26例脑胶质瘤NDRG2mRNA表达低于瘤旁组织(0.95±0.16vs1.54±0.18,P<0.05)，按WHO胶质瘤病理分级Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级NDRG2表达量分别为：1.12±0.14，1.03±0.12，0.42±0.09，随胶质瘤恶性程度增高NDRG2mRNA表达量逐步减少，其中Ⅳ级胶质瘤NDRG2表达量低于Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤(P<0.05，图1).

aP<0.05vs瘤旁;cP<0.05vsⅡ，Ⅲ级.

图1实时定量PCR检测胶质瘤中NDRG2mRNA相对表达量(略)

2.2胶质瘤中蛋白激酶PKC?αmRNA的表达分析26例脑胶质瘤PKC?αmRNA表达量高于瘤旁组织(1.23±0.11vs0.97±0.18，P<0.05)，胶质瘤病理分级Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级PKC?α表达量分别为：1.00±0.17，1.21±0.14，1.45±0.18，有随胶质瘤恶性程度增高PKC?αmRNA表达略增加的趋势(P>0.05，图2).

aP<0.05vs瘤旁.

图2实时定量PCR检测胶质瘤中PKC?αmRNA相对表达量(略)

2.3相关性分析在mRNA表达水平还不能认为NDRG2与PKC?α之间有线性相关关系(r=0.233，P>0.05).

3讨论

以往在基因表达量方面的研究多采用RT?PCR灰度扫描半定量法，因受扩增循环数难以准确设定、扫描软件本身有局限性等因素的影响，结果的可靠性难以保证.本实验采用实时定量PCR技术，它是由PCR扩增进入指数增长期时的循环数(CT值)换算出目的基因初始产物量进行比较，避免受平台期的影响，所以能够较准确的进行定量[6].

以往研究结果表明，NDRG2在多种肿瘤组织及细胞系低表达或不表达，建立NDRG2可诱导表达细胞系诱导NDRG2表达后，可导致细胞出现明显的G1期阻滞，提示了该基因有抑制细胞过度增殖的作用[7].但因NDRG2是近年来发现的新基因，其在肿瘤中表达缺失的原因，其抑制肿瘤生长的机制等一系列问题还有待于深入探讨.PKC?α是一种与肿瘤发生相关的蛋白激酶[8]，在原发性肝癌、小细胞肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中均发现PKC?α高表达，反义PKC?αmRNA能够促进黑色素瘤细胞凋亡[9]，说明PKC?α对一些肿瘤的发生有一定的调控作用.

我们在实验中对胶质瘤及瘤旁组织NDRG2，PKC?αmRNA表达分别进行实时定量PCR检测，发现26例脑胶质瘤NDRG2mRNA表达低于瘤旁组织(P<0.05)，PKC?αmRNA表达高于瘤旁组织(P<0.05)，随胶质瘤恶性程度增高NDRG2表达逐渐减少(P<0.05)，PKC?α表达有略增加的趋势.说明NDRG2，PKC?α表达状况可能与胶质瘤的发生及恶性演变有关.因为PKC是通过对其下游靶蛋白进行磷酸化修饰而发挥调控作用，NDRG2蛋白有3个与PKC蛋白相互作用的磷酸化位点，PKC蛋白过表达时能够诱导NDRG2磷酸化[10]，说明PKC介导的信号转导通路对NDRG2有调控作用.然而，我们在mRNA表达水平未发现NDRG2与PKC?α有相关性(P>0.05)，这可能与我们实验中的样本量较少有关，进一步的实验，我们可以从蛋白水平，PKC，NDRG2的磷酸化激活与抑制等方面研究PKC和NDRG2之间的相互作用，了解PKC对NDRG2磷酸化调控后的生物学效应，以便于进一步揭示NDRG2在肿瘤发生发展中所发挥的作用.

总之，脑胶质瘤是神经系统常见肿瘤，且恶性胶质瘤生存期短，死亡率高，治疗困难.因此，探索胶质瘤的发病机制和抑制肿瘤生长机制的研究对攻克胶质瘤有深远的意义.我们在研究中发现胶质瘤中NDRG2表达减少、PKC?α表达增多，且与胶质瘤恶性程度有关，说明NDRG2，PKC?α可能在胶质瘤的发生及恶性演变中发挥了一定的作用，为进一步探索胶质瘤的发病机制提供了实验依据.