姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响

【摘要】目的:观察姜黄素对肿瘤坏死因子?α（TNF?α）引起的血管内皮细胞分泌单核细胞趋化因子?1(MCP?1)的影响.方法：采用原代培养方法获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），随机分为对照组、TNF?α刺激组和TNF?α＋姜黄素组.先用TNF?α刺激血管内皮细胞0.5h，再加入不同浓度的姜黄素(6.25,12.5,25,50和100mg/L)共同孵育1h与单纯TNF?α刺激作对照，采用MTT法、ELISA法和RT?PCR法检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP?1蛋白表达的影响.结果:HUVEC经TNF?α刺激0.5h后，其MCP?1表达为159.37±4.47，与对照组94.13±6.07相比明显增强（P<0.01）；再与不同浓度姜黄素共同孵育1h后，MCP?1在细胞中的表达分别为：137.63±4.50,121.72±1.96,116.08±3.93和101.62±4.12，与单纯给予TNF?α刺激相比明显减弱（P<0.01），且随着浓度升高有递增的趋势.结论:姜黄素通过抑制炎症因子MCP?1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥保护血管内皮细胞，防止动脉粥样硬化的作用.

0引言

研究表明，单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白?1（MCP?1）来实现,多种物质及细胞因子都可以诱导MCP?1的表达［1］.肿瘤坏死因子?α通过诱导内皮细胞而产生MCP?1,吸引单核细胞迁入动脉内膜而参与动脉粥样硬化的发生和发展.中药姜黄的有效成分姜黄素具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用，但目前的研究主要围绕其对脂质过氧化的抑制及对细胞间黏附分子?1、血管细胞黏附分子?1和P?选择素等炎性因子的表达的抑制作用等方面［2-3］,而对血管内皮细胞中MCP?1表达影响的研究尚少见报道.本实验通过在离体状态下以肿瘤坏死因子?α为诱导因子，观察姜黄素对MCP?1的影响，旨在进一步阐明其保护内皮细胞，抗动脉粥样硬化的作用机制.

1材料和方法

1.1材料新生儿脐带由第四军医大学唐都医院妇产科提供；倒置显微镜（日本Olympas公司）；M199培养基、胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；姜黄素，TNF?α（美国Sigma公司）；噻唑蓝（北京华美公司）；兔抗人MCP?1mAb，ELISA试剂盒（北京中山试剂公司）；Ⅷ因子多克隆抗体（武汉博士德公司）；RT?PCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；PCR所用引物由上海生工公司合成.

1.2方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养及鉴定无菌条件下，取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带约30cm，用PBS反复冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳夹住脐带一端，注入0.4g/LⅠ型胶原酶10mL后夹住另一端，在50mL/LCO2孵育箱中消化30min后收集消化液，1000r/min离心8min后收集细胞，加入含80g/L胎牛血清的M199培养液，接种于25mL培养瓶中，在37℃，50mL/LCO2孵育箱中待细胞生长至融合状态用1.0g/L胰蛋白酶和0.16g/L乙二胺四乙酸混合液消化传代，实验采用第3代细胞，采用SP免疫组织化学染色法［3］检测人第Ⅷ因子相关抗原.

1.2.2噻唑蓝（MTT）法观察姜黄素对内皮细胞的作用将对数生长期的细胞按密度为1.0×104/L接种于96孔板中，每孔加100μL细胞悬液，当细胞贴壁后进行药物干预并在37℃，50mL/LCO2孵箱中继续培养.实验分为对照组：M199培养液；TNF?α刺激组：M199培养液中加入终浓度为10μg/L的TNF?α；TNF?α＋姜黄素刺激组：先加入浓度为10μg/L的TNF?α孵育细胞0.5h，再分别加入终浓度为6.25,12.5,25,50和100mg/L的姜黄素,各组均在37℃条件下孵育1h，每组设4个复孔.实验终止前每孔加入MTT10μL继续培养4h，终止培养.吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100μL，振荡10min,置酶联免疫检测仪上测定570nm波长处的A值，计算细胞增殖抑制率.计算公式：细胞生长抑制率（％）＝（1-试验组A值/对照组A值）×100％

1.2.3姜黄素对内皮细胞中MCP?1表达的影响

1.2.3.1ELISA法检测实验分组同1.2.3主要步骤:在含有兔抗人MCP?1mAb包被的酶标板上,分别加入MCP?1500,250,125，62.5，31.25，15.62,7.81和0ng/L标准品和1∶4稀释的待测细胞上清液各0.1mL,37℃孵育1h；洗板后每孔加入辣根过氧化物酶标记的工作液,37℃孵育1h；清洗后加入邻苯二胺底物液0.1mL,置暗处反应10min,每孔加入终止液0.05mL终止显色反应.在酶联免疫检测仪上492nm波长处测各孔A值,每组6个样本,每个样本均设定复孔.

1.2.3.2半定量RT?PCR检测实验分组同1.2.3.按Trizol法提取细胞总RNA.逆转录合成cDNA，MCP?1基因引物：上游5′CTCATAGCAGCCACCTTCAT3′(20bp)，下游5′TCACAGCTTCTTTGGGACAC3′(20bp)；β?αctin引物：上游5′gggACCTgACTAACTACCTC3′，下游5′CAgTgATCTCCTTCTgCATC3′；PCR扩增条件：94℃温育2min，94℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，末次循环72℃延伸10min.反应结束后15g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值.用目的基因与β?actin基因扩增片段的灰度值之比计算表达水平.

统计学处理：实验数据均以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件进行方差处理，采用LSD法进行检验,P＜0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1HUVEC的鉴定相差显微镜下观察细胞大部分贴壁，呈单层扁平梭形相互嵌合或多角形细胞集落，排列呈“铺路石”样（图1A）.经SP染色法后镜下可见细胞胞质丰富，并呈棕黄色染色颗粒，为阳性反应，证实细胞来源于HUVEC细胞（图1B）.

A：倒置显微镜下×100;B：倒置显微镜下经Ⅷ因子染色×20.

图1原代培养的HUVEC细胞及鉴定（略）

2.2黄素对TNF?α损伤后内皮细胞的影响MTT检测显示,TNF?α刺激组中细胞的抑制率为（31.9±2.8）%,明显高于对照组（16±1.0）%，(P<0.05）；TNF?α＋姜黄素（12.5,25,50和100mg/L）各浓度组抑制率分别为（25.9±1.5）%,（21±0.6）%,（17.5±1.3）%和（9.6±0.6）%,与TNF?α刺激组相比较内皮细胞的损伤明显减轻（P<0.01）.

2.3姜黄素对TNF?α损伤状态下内皮细胞MCP?1表达的影响

2.3.1姜黄素对MCP?1蛋白表达的影响细胞经TNF?α刺激0.5h后与对照组（94.13±6.07）相比，MCP?1表达明显增加（159.37±4.47，P<0.01）；HUVEC细胞先经TNF?α刺激后再加入12.5,25,50和100mg/L不同浓度姜黄素继续作用1h后，与对照组相比较，可明显抑制TNF?α介导的MCP?1表达（137.63±4.50,121.72±1.96,116.08±3.93,101.62±4.12,P<0.01）且呈现出浓度依赖趋势，但与对照组相比在低浓度时仍明显增高，说明姜黄素有部分逆转TNF?α对细胞的损伤作用.

2.3.2黄素对MCP?1mRNA表达水平的影响HUVEC细胞经不同浓度姜黄素和TNF?α分别干预后β?actin基因的表达产物几乎保持不变，但目的基因表达产物在TNF?α组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少（图2）.计算结果显示，TNF?α刺激组（0.493±0.021）与对照组（0.197±0.009）相比较MCP?1表达水平明显升高（P<0.01）；而TNF?α+姜黄素（12.5,25,50和100mg/L）各浓度组与对照组相比MCP?1表达水平虽仍有升高，但较TNF?α刺激组明显降低（0.349±0.019,0.342±0.007,0.298±0.029，0.249±0.001，P<0.05）.

M：markerDL2000；1：对照组；2：TNF?α刺激组；3～7：依次为姜黄素6.25,12.5,25,50和100mg/L不同浓度组.

图2各组MCP?1mRNA表达RT?PCR扩增产物电泳结果（略）

3讨论

姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，本实验以内皮细胞损伤为基础，从MCP?1的角度，在分子水平继续探讨姜黄素保护内皮细胞的机制［4］.MCP?1作为一种趋化因子,在致炎因子TNF?α作用下可诱导其表达［5］，MCP?1表达升高后可引起单核细胞和内皮细胞表达黏附分子、促进炎症因子的释放，从而介导血管内皮细胞的损伤［6］，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润,而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖,对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用［8］.目前，可抑制细胞中MCP?1高表达的药物主要有胰岛素、噻唑烷二酮衍生物、二甲双胍、血管紧张素转移酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物等［9］，而传统中药姜黄素与它们相比则具有毒副作用小，使用安全的优点.

本实验结果显示，常规培养的HUVEC细胞能分泌少量MCP?1，在TNF?α（10μg/L）刺激后，MCP?1分泌显著增加（31.9±2.8）%，与文献报道一致［7-8］，当用不同浓度的姜黄素作用于损伤细胞后，与TNF?α刺激组相比能明显下调MCP?1mRNA的水平（P<0.05）；同时ELISA法也显示，当姜黄素浓度达到100mg/L时，MCP?1蛋白表达为101.62±4.12,与TNF?α刺激组159.37±4.47比较,差异具有统计学意义（P<0.01），并且随着姜黄素浓度的升高这种保护作用逐渐增强.我们的实验结果表明姜黄素可以抑制MCP?1的表达，且具有浓度依赖趋势.因此，我们认为姜黄素抑制MCP?1的部分机制是从MCP?1转录水平上实现的，姜黄素所致的MCP?1mRNA表达下调可减少TNF?α对HUVEC细胞造成的损伤.核转录因子?kB（NF?kB）可能是介导MCP?1表达和产生的最重要核转录因子，MCP?1表达增加常与NF?κB的活化相关［10］.而姜黄素是否也通过直接或间接阻断NF?kB的信号传导途径，抑制其活化，进一步减少MCP?1的表达，从而起到保护血管内皮的作用还有待更深入的研究.