肺炎链球菌转化模型的建立

【摘要】目的：建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型，以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法：分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞，转化外源DNA，获取发生了转化的菌株，通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化；并计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较两者的转化率，以确定更佳的转化模型.结果：肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为（0.89±0.20）％，（0.71±0.10）％，高于既往方法的转化率［分别为(6.2±1.4)×10-3％，(5.7±1.1)×10-3％］，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型.结论：改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化，能方便研究者对该菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.

【关键词】肺炎链球菌；转化，细菌；感受态

0引言

转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态（特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态），摄取外源性DNA，通过同源重组导致基因发生改变的过程.通过转化可以改造细菌基因，进行功能基因组研究，它是研究肺炎链球菌（S.pn）生物学功能的重要手段.本课题组既往的S.pn实验室转化模型［1］有两大弊端：一是转化效率不稳定；二是感受态开放时间较短，不能满足大规模转化的需要.有研究［2］认为冷刺激可能会延长感受态开放时间，我们据此对既往转化模型进行改良，即冷冻处理细胞后再做转化，以期克服其弊端.

1材料和方法

1.1材料S.pn血清4型标准菌株TIGR4(ATCC?BAA334)，干粉（美国ATCC微生物菌种保存中心）；S.pn血清3型标准菌株CMCC(B)31203，干粉（中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心）；SⅡ型S.pn(1和2号菌株)由中国医科院提供；主要遗传特征经鉴定合格.C+Y培养基：含5g/LYeast提取物（LacksandHotchkiss,1960）；TSA血平板：含50mL/L兔脱纤维全血.感受态刺激因子（CSP2）由挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠；S.pnCP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）由美国Morrison教授惠赠；S.pn1d菌株的基因组DNA(含红霉素抗性基因erm的comE断裂基因)由本课题组构建［3］；DNA提取试剂盒（上海华舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）.722分光光度仪（上海仪器分析三厂）；-80℃低温冰箱（日本SANYOMedicalfreezerMDF330型）.

1.2方法

1.2.1S.pn的生长曲线绘制挑取S.pn单个菌落接种于C+Y培养基，37℃培养12h，转接于20mLC+Y培养基中，于37℃水浴孵育，从1h后开始在分光光度仪上测菌液A620nm值，之后每隔1h取样1次.以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.

1.2.2改进的S.pn实验室转化模型的建立

1.2.2.1改进的S.pn实验室转化模型取冻存于-80℃冰箱的S.pn菌株，培养于CTM培养基（含C+Y培养基，1mmol/LCaCl2，0.1g/LBSA）中，37℃水浴至A550nm＝0.1左右时，将甘油加入上述菌液中，至其终浓度为100mL/L，分装后冻于-80℃，此即为S.pn感受态细胞；24h后取出冻存菌液，在冰上融化，9000g离心1min，弃去上清液，加入100μLC+Y培养基（pH8.0），使沉淀彻底悬浮，加入CSP20μg/L，同时加入S.pnCP1250的染色体DNA100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48h，即得到转化菌落.

1.2.2.2方法学比较取冻存于-80℃冰箱的S.pn菌株，分别用上述改进方法和既往方法［1］制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP220μg/L，并加入S.pnCP1250的染色体DNA100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48h，计数抗生素血平板上的转化菌落.转化率=平板菌落数/细菌总数×100%.其中，细菌总数按A620nm=0.6时，细菌数为5×1011cfu／L计算.

1.2.3S.pn感受态缺陷菌株的制备及鉴定

1.2.3.1感受态缺陷菌株的制备用上述改进的转化方法制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP220μg/L，及含comE断裂基因的染色体DNA（即S.pn1d菌株DNA）100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含0.25mg/L红霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48h，挑取平板上的转化菌落，接种于含0.25mg/L红霉素的C+Y培养基中，37℃培养增菌，当菌密度为A620nm=0.2左右时，冻于－80℃冰箱保存，即得到缺陷菌.

1.2.3.2感受态缺陷菌株的鉴定鉴定1：将野生菌和缺陷菌同时做转化，选用CP1250的DNA为外源基因.鉴定2：提取野生菌和缺陷菌的染色体DNA，用comE（5′?TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG?3′，5′?ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC?3′）和erm（5′?CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT?3′，5′?AGTCGGCAG?CGACTCATAGAAT?3′）的引物［4］做PCR.加入comE或erm的上、下游引物5μmol/L，加入MgCl22.5μmol/L，TaqplusDNA聚合酶1U.循环参数为95℃5min预变性；94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,30个循环；72℃10min.15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.

统计学处理：根据资料类型采用t检验，以P<0.05为差别有统计学意义(双侧).

2结果

2.1S.pn的生长曲线S.pn菌株334和31203的生长曲线无明显差别，生长情况基本一致（图1）.

图1肺炎链球菌334和31203菌株的生长曲线（略）

2.2改进的S.pn实验室转化模型获得S.pn334和31203菌株的转化菌株，转化率分别为1.03％和0.82％.方法学比较实验结果显示，S.pn菌株334和31203用改进转化模型后，两株细菌的转化率皆比用既往转化模型的转化率高两个数量级，差异有统计学意义（P<0.05，表1），改进转化模型的转化效率明显优于既往转化模型.

表1肺炎链球菌（S.pn）334和31203菌株用不同转化模型的转化率比较（略）

aP<0.05vs既往方法.

2.3S.pn感受态缺陷菌株的获得利用含comE断裂基因的染色体DNA转化S.pn334，31203，1和2号菌，分别得到转化菌落，即为S.pn感受态缺陷菌，转化率分别为0.90％，0.75％，6.80％和9.40％.鉴定1：将野生菌和缺陷菌同时转化抗链霉素(str)的DNA，野生菌获得转化菌株，而缺陷菌无一个菌落生长.鉴定2：以野生菌和缺陷菌的染色体DNA为模板，以comE和erm的引物做PCR，缺陷菌分别在1515bp和726bp处有产物，而野生菌则无这两个片段的产物（图2）.

M：2000bpladderDNAmaker；1～4：获得的S.pn334，31203，1，2号菌株的感受态缺陷菌DNA含有erm基因；5～8：获得的S.pn334，31203，1，2号菌株的感受态缺陷菌DNA含有comE断裂基因.

图2肺炎链球菌感受态缺陷菌株（略）

3讨论

S.pn是自然界可以发生自然转化的一种条件致病菌，在目前发现的可以发生自然转化的几种细菌中，S.pn的转化率最高［5］.转化后可发生基因同源重组，因而还是基因敲出、基因突变的有利工具，对于细菌功能学的研究很有帮助，因此我们需要掌握S.pn在实验室的稳定、高效的转化模型，以便于对其基因功能以及致病机制进行深入研究.S.pn的转化受密度感应系统的控制，当细菌生长到一定密度时，感受态会受到抑制，自然状态下，S.pn感受态开放时间仅十几分钟，所以很难在实验室条件下捕捉到S.pn的自然转化.人工纯化合成的CSP能诱导S.pn转化，使S.pn在实验室转化成为现实.然而既往的转化模型不够稳定，且不适合大量连续的实验室转化，有待改进.S.pn的荚膜较厚，会妨碍外源DNA的转入，冷冻处理可能会减弱S.pn荚膜的形成，使其转化率增加［6］，且有研究认为冷刺激会延长细菌感受态开放时间，因此我们在细菌自然生长合适的菌密度时（许多研究认为此时S.pn处于自然转化期）冷冻S.pn感受态细胞，然后利用CSP进一步诱导S.pn转化.

本课题组的前期实验［1］已摸索出适合S.pn31203的转化培养基、pH及培养时间（菌密度）等，我们通过绘制31203菌株和334菌株的生长曲线，发现两者的生长情况基本一致，因此对334菌株采用相同的转化体系和条件.我们的结果显示，在实验室条件下，运用选定的转化体系和条件，能将外源DNA转入细菌，且改变了细菌的生物学性状，使其产生了抗生素抗性，成功地建立了改进的S.pn实验室转化模型.两种菌株采用改进的转化模型后，其转化率均明显高于既往转化模型，说明冷冻处理感受态细胞能有效提高其转化率；且改进模型可以一次制备大量S.pn感受态细胞，操作简便，可连续使用感受态细胞.因此改进的S.pn实验室转化模型相当稳定、高效.

comE是调控S.pn感受态的关键基因，各种环境因素对S.pn转化发生的调节都是通过直接或间接方式影响comE的表达来实现的［7-8］.我们选用该基因为目的基因，将含comE断裂基因的DNA转入野生菌，得到感受态缺陷菌株，实验证明这些缺陷菌的确不能发生转化，可用于下一步相关研究.说明可以通过稳定的实验室转化模型，改造那些具有自然转化特性的细菌（如S.pn）的各种基因，进而观察细菌发生的变化.采用这种模型方便了对细菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.

致谢美国加州大学Morrison教授惠赠CP1250的DNA，挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠CSP2，在此表示衷心感谢.