雷公藤红素阻断全反式维甲酸导致的白血病细胞

维甲酸综合征是全反式维甲酸（all-transretinoicacid，ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）过程中出现的一种具炎症性特征和能导致死亡的严重并发症。其发生机制虽不完全清楚，但一般认为，与ATRA导致白血病细胞与内皮细胞的黏附能力增加，进而使大量细胞浸润组织和器官有关［1～3］。最近，我们发现，雷公藤红素能抑制炎症因子活化的人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalvascularendothelialcell，HUVEC）表达黏附分子，并抑制内皮细胞与白细胞的黏附［4］，提示其有可能用于维甲酸综合征的治疗。本研究以急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和HUVEC为细胞模型，观察雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与HUVEC黏附增加的影响。

1材料与方法

1.1试剂ATRA，Sigma公司产品，用无水乙醇溶解，贮存浓度为100mmol/L，-20℃冰箱中保存。工作浓度为1μmol/L，用培养液临时配制。雷公藤红素，上海中山医院药剂科提取及纯化，方法见文献［5］，DMSO溶解，贮存浓度为100mmol/L，-20℃冰箱中保存，工作浓度为200nmol/L，用培养液临时配制。荧光直标鼠抗人VCAM-1-PE和E-selectin-PE，美国BD公司产品;鼠抗人ICAM-1-FITC，法国Diaclone公司产品。

1.2NB4细胞培养NB4细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供（源自美国ATCC）。RPMI1640（Invitrogen，法国），10%小牛血清（Cambrex，法国），1%青霉素-链霉素，37℃，5%CO2培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3HUVEC培养HUVEC细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供。分离及培养方法见文献［4］。EBM2培养液（Invitrogen，法国），加5%小牛血清，1%青霉素-链霉素，0.4%重组人纤维母细胞生长因子-B（recombinanthumanfibroblastgrowthfactor-B，rhFGF-B）、0.1%重组人血管内皮生长因子（recombinanthumanvascularendothelialgrowthfactor，rhVEGF）、0.1%长效胰岛素样生长因子（longRinsulin-likegrowthfactor，R3-IGF-1）和0.1%重组人上皮生长因子（recombinanthumanepidermalgrowthfactor，rhEGF），均为法国Cam-brex公司产品，37℃，5%CO2培养。取3～5代的HUVEC进行实验。

1.4NB4细胞上清液的制备取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml加入培养体系进行传代培养。设对照、雷公藤红素、ATRA、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。37℃，5%CO2培养24h。300g离心5min，弃细胞，再1200g离心10min，收集上清，-20℃冻存。

1.5ATRA和雷公藤红素对NB4细胞黏附分子表达的影响取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml进行培养。设对照、雷公藤红素、ATRA、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。37℃，5%CO2培养24h［2］。选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascularcelladhesionmole-cule-1，VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（intercellu-laradhesionmolecule-1，ICAM-1）的表达情况用流式细胞术检测［4］。

1.6NB4细胞上清液对HUVEC表达黏附分子的影响取贴壁生长良好的HUVEC，按5×104/ml，接种于24孔培养板中，每孔1ml。待细胞长满时，分别加入NB4细胞上清液（与培养液等体积），设对照组，均设复孔。E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的检测同1.5。

1.7抗体标记取1×105个细胞，PBS清洗两遍后，分别与荧光直标鼠抗人E-selectin-PE、VCAM-1-PE和ICAM-1-FITC，于4℃反应30min，总体积20μl。然后转移至含PBS的流式细胞仪测定管，总体积250μl。

1.8流式细胞术检测FACSCalibur（美国BD公司）的发射激光由氩离子激光器产生，功率为15mW，激发光波长为488nm。FITC和PE荧光分别设在FL-1和FL-2荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集10000个细胞，采用CellQuest软件进行结果分析。

1.9细胞黏附功能实验NB4细胞和HUVEC分别接受ATRA、雷公藤红素和NB4细胞上清液处理24h后，按试剂盒（法国MolecularProbes公司）操作说明书进行。取5×105未处理或处理的NB4细胞，用PBS洗两遍后，悬浮于1ml不含血清的RPMI1640培养液中。加5μl荧光染料calceinAM于悬浮细胞，使calceinAM最后浓度为5μmol/L，充分混匀后，置37℃孵育30min。然后用预温的RPMI1640洗两遍，重新悬浮并调整细胞浓度为5×105/ml。取标记好的细胞100μl放于长满HUVEC（未处理或处理）的96孔板内，于37℃孵育30min，取出后，在摇床上轻轻震荡3min，吸弃上清，然后用不含酚红的RPMI洗4遍后，每孔加200μlPBS。用荧光读板机（BioTek，德国）读取结果（吸收光谱494nm，发射光谱517nm）。1.10统计学方法每组实验重复3次，用组间t检验对结果进行统计分析。

2结果

2.1ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用NB4细胞表面与细胞黏附相关的E-selectin和VCAM-1表达很低，ICAM-1有少量的表达。NB4细胞被ATRA诱导24h后，其表面E-selectin和VCAM-1的表达无明显变化（P>0.05），但ICAM-1的表达明显增加（P<0.01）。雷公藤红素不改变ATRA诱导后的NB4细胞表达E-selectin和VCAM-1（P>0.05），但能明显降低其ICAM-1的表达水平（P<0.01）。见表1。

2.2雷公藤红素对NB4细胞上清液刺激HUVEC表达黏附分子的影响HUVEC未接受刺激时，E-selectin、VCAM-1和ICAM-1呈现为低水平表达。NB4细胞上清液刺激HUVEC24h后，不能增加HUVEC表面E-selectin和VCAM-1的表达（P>0.05），但能使其ICAM-1的表达水平增加（P<0.05）。ATRA诱导24h后的NB4细胞上清液，能使HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的表达均明显增加（P<0.01）。对被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1，雷公藤红素可明显抑制，其抑制率分别达到25.3%、42.4%和61.0%。见表2。

2.3雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与HUVEC黏附能力改变的影响与对照组相比，ATRA诱导24h的NB4细胞，与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率约增加了（14.7±3.4）%。雷公藤红素+ATRA共处理的NB4细胞，其与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率下降至对照组的（96.1±0.2）%;被NB4细胞上清液刺激24h的HUVEC，与ATRA诱导24h的NB4细胞进行黏附，结果显示，与NB4细胞上清液组相比，ATRA诱导的NB4细胞上清液使HUVEC与ATRA诱导24h的NB4细胞之间的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而与NB4细胞上清液组相比，雷公藤红素能使其黏附率下降至（95.1±18.4）%。见图1、2。

表1ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用（略）

Table1ATRA-inducedexpressionsofadhesivemoleculesinNB4cellsandtheblockingeffectsoftripterine

**P<0.01，vscontrolgroup;△△P<0.01，vsATRAgroup.

表2雷公藤红素对NB4培养上清刺激HUVEC表达黏附分子的影响（略）

Table2EffectoftripterineonexpressionsofadhesivemoleculesinHUVECstimulatedbyconditionedmediumofNB4

*P<0.05，**P<0.01，vscontrolgroup.CM:conditionedmedium.

图1NB4细胞不同处理后与HUVEC黏附（略）

Figure1NB4celladhesiontounstimulated

HUVECNB4cellswereculturedwith1μmol/LATRA，200nmol/Ltripterineorthevehiclefor24hbeforetheadhesionassay.Theresultsareex-pressedaspercentageofrelativeadhesioncomparedwiththecontrolandaremean±SDofthreeexperiments.

图2HUVEC不同处理后与NB4细胞（ATRA诱导）黏附（略）

Figure2HUVECadhesiontoATRA-treatedNB4cells

HUVECwereculturedwithNB4cellconditionedmedium（NB4-CM），ATRA-NB4-CM，ATRA+tripterine-NB4-CMortripterine-NB4-CMfor24hbeforetheadhesionassay.Theresultsareexpressedaspercentageofrelativeadhesioncomparedwiththecon-trolandaremean±SDofthreeexperiments.

3讨论

多个研究表明，APL细胞的黏附能力增加、以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附增加，是ATRA治疗引起维甲酸综合征发生的主要机制之一［1～3，6］。因此，阻断黏附增加，被认为是治疗维甲酸综合征的策略之一。本研究首次发现，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子;抑制ATRA处理的NB4细胞上清液刺激HUVEC表达黏附分子;而且ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加，能被雷公藤红素完全抑制。雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的三萜类单体，有很强抗炎能力［7～10］。我们最近的研究结果显示［4］，对内皮细胞培养无毒性剂量（20～200nmol/L）的雷公藤红素，能够通过阻断肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）等炎症因子导致的核转录因子-κB（nucleartranscriptionfactor-κB，NF-κB）向细胞核内转移，从而抑制被这些因子活化的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子。受此启发，本研究观察雷公藤红素对ATRA导致的APL细胞与内皮细胞黏附增加的影响，并且也采用200nmol/L的雷公藤红素作为本实验剂量。本研究首先观察了雷公藤红素对ATRA导致的NB4细胞表面黏附分子表达增加的影响。发现ATRA导致NB4细胞表面黏附分子ICAM-1的表达明显增加（P<0.01），与文献报道［2，11］相符，而雷公藤红素明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表面ICAM-1的表达（P<0.01）。而ICAM-1在ATRA引起的APL细胞之间的黏附聚集，以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附中起重要作用［2，11］。

事实上，APL细胞与内皮细胞之间黏附增加取决于两个方面:一是APL细胞表达黏附分子增加;二是内皮细胞表达黏附分子也增加。有报道，ATRA导致APL细胞分泌IL-1β能力增加［12，13］，而IL-1β能活化内皮细胞，使其表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1被诱导性表达增加，增强内皮细胞的滚动黏附、紧密黏附的能力［14］。在我们的研究中，ATRA本身无明显刺激HUVEC表达黏附分子作用，NB4细胞培养上清液也仅能增加ICAM-1的表达，但经ATRA诱导的NB4细胞培养上清液能明显刺激HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子（P<0.01），而雷公藤红素对其抑制率分别达到25.3%、42.4%和61.0%。这可能是雷公藤红素阻断了ATRA诱导的NB4细胞上清液中的炎症因子对HUVEC的活化能力。正如前述，细胞间黏附的本质是黏附分子的表达，雷公藤红素能抑制ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子，抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子，提示雷公藤红素也可能会抑制两者之间的相互黏附，为此，我们进行了两种模式的细胞黏附功能试验。

实验结果证实，ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（未被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）黏附率增加了（14.7±3.4）%，雷公藤红素对其能完全抑制;ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而雷公藤红素对其亦能完全抑制。其抑制效果好于用单克隆抗体各自封闭HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1［2］。综上所述，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子、抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子、完全抑制ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加等研究表明，雷公藤红素在阻断ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加方面有显著效果，提示雷公藤红素作为中药单体，有望成为治疗维甲酸综合征的新药物，但实际效果有待动物实验和临床进一步证实。