肾炎2号防治IgA肾病大鼠的实验

【摘要】［目的］观察肾炎2号对IgA肾病大鼠的防治作用，并探讨其作用机理。［方法］使用口服和尾静脉注射牛血清白蛋白（BSA）的方法制作大鼠IgA肾病模型，治疗组、对照组造模同时分别给予肾炎2号（15g/kg）和福辛普利（4.17mg/kg）至12周末。观察尿常规、24h尿蛋白定量、血常规、肝肾功能的变化及肾组织的病理改变。［结果］1.各组大鼠尿常规均未见红细胞。2.治疗组、对照组第7～12周末24h尿蛋白定量较模型组明显降低（P<0.01），但治疗组与对照组比较无显著的差别（P>0.05）。3.各组血常规和肝肾功能相比无明显统计学差异（P>0.05）。4.与模型组比较，治疗组大鼠肾组织系膜区IgA沉积减少；系膜基质、系膜细胞增生程度减轻，但治疗组、对照组相比无明显统计学差异（P>0.05）。［结论］肾炎2号具有降低蛋白尿、抑制系膜区IgA沉积、减少系膜基质和系膜细胞增生的作用，与西药福辛普利相比无明显差异。

IgA肾病（IgAN）是世界范围内常见的进展性的原发性肾小球疾病，诊断后每10年约有15%～20%的患者进展到慢性肾功能衰竭，严重影响患者的生活质量。现代医学迄今尚无特异的治疗方法，而中医药在控制临床症状，减少蛋白尿，延缓肾功能衰竭进程，提高病人的生活质量上有一定的优势。

肾炎2号是浙江中医药大学附属第一医院李学铭主任医师的经验基础方，多年的临床观察表明对该方的辨证加减能有效减少IgAN患者的蛋白尿，并改善患者的临床症状。但未能知晓肾脏病理改善的情况，只能从某些血、尿指标或与作用机制相关指标的改善来大致推测其作用机理。为进一步研究肾炎2号治疗IgA肾病的效果及作用机理，我们设想通过复制IgA肾病模型探讨肾炎2号对实验肾炎大鼠的防治作用及可能的机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组SD纯种大白鼠,雌性40只,体重（140±10）g,12周龄，浙江中医药大学动物实验中心提供。动物适应性喂养1周后，将尿常规阴性动物随机分为正常组、模型组、西药对照组、中药治疗组4组,每组各10只。

1.2试剂及仪器牛血清白蛋白（BSA）,宝灵曼公司。POLYCLONALANTIBODY,GOATANTIRATIgA：FTIC，SEROETLtd提供。鼠抗人α－平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司。二步法抗鼠/兔通用型免疫组化试剂盒，GeneTech（Shanghai）CompanyLimited提供。肾炎2号（由生黄芪、雷公藤、制大黄、红花、银花等颗粒剂组成，江苏江阴天江药业有限公司，浙江中医药大学附属第一医院中药房配制），稀释成1.5g/ml的溶液。福辛普利片剂（剂量10mg），上海施贵宝有限公司，用蒸馏水稀释成4.17mg/kg的溶液。LEICARMI135切片机、LEICACM1850冰冻切片机、LEICATCS?SP型激光共聚焦显微镜、LEICA病理图象分析系统、LYMPUSBX60显微镜。

1.3实验方法

1.3.1造模及治疗IgA肾病模型制备参照Emancipator等［1］报道方法，即隔日口服含0.1%BSA的酸化水，6周后定期尾静脉注射1%BSA缓冲液（每日1次，连续3次），然后观察至第12周末。中药治疗组、西药对照组的造模与模型组相同，并于造模开始即分别用肾炎2号（剂量为15g/kg）、福辛普利片（4.17mg/kg）灌胃给药，至第12周末。正常组隔日口服酸化水，共12周。在上述12周内,各组动物进食进水量不限。从第7周末起用代谢笼留尿，每周查尿常规及24h尿蛋白定量。实验动物在12W周末，禁食12h，3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，剖腹，腹主静脉取血，测血常规、血清肌酐、尿素氮、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶。然后取出双肾组织进行光镜、免疫荧光观测。

1.3.2检测项目及方法尿常规及沉渣镜检：尿常规采用LINITEK500尿常规分析仪检测；24ｈ尿蛋白定量：比色法。血常规：COULTERLH750ANALYZER血常规自动分析仪。血液生化：血清肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）、血白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）:采用SYNCHRONclinicalsystemLX20全自动生化分析仪检测。肾组织光镜观察所取组织用10％福尔马林固定液固定,切成3μｍ厚的切片,用HE常规染色，最后在olympusBX60光学显微镜下观察肾组织的病理形态学的改变。肾组织免疫荧光观察：用组织包埋剂OCT将新鲜组织包埋后，液氮速冻，由LEICACM1850冰冻切片机切成4μｍ后的切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上室温晾干。放入PBS内轻洗1min×3次。滴加羊抗大鼠免疫荧光IgA（异硫氢荧光素标记）抗体稀释液，37℃避光孵育45min。用蒸馏水轻洗1min（三道）后用纸吸干切片表面的水液，即刻在LEICATCS?SP型激光共聚焦显微镜显微镜下观察。

1.4统计方法运用SPSS11.5统计软件进行数据处理，本文资料均用（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用S?N?Q检验。

2结果

2.1尿常规见图1。实验结果显示第7周末起模型组中尿常规可见有蛋白尿，到第9周末达100％，对照组、治疗组亦可见蛋白尿，但随着用药时间的延长，蛋白尿逐渐减少。正常组蛋白尿阴性。

（1-模型组，2-对照组，3-治疗组）

图1尿常规（略）

2.224h尿蛋白定量情况见表1。

表1各组大鼠24h尿蛋白定量检测情况（略）

▲模型组24hUPro与其它各组比较，P<0.01。＊与模型组相比P<0.01。★与对照组比较，P>0.05。●第7、8、12周末对照组、治疗组24hUPro与正常组比较，P<0.01。◆第9、10、11周末对照组、治疗组24hUPro与正常组比较，P>0.05

2.3血清Scr、BuN、Alb、ALT、AST检测结果:见表2。

表2各组大鼠Scr、BUN、Alb、ALT、AST检测情况（略）

△＊★●◆各组Scr、BUN、Alb、ALT、AST相比不具有统计学上的差异，P>0.05

2.4血常规见表3。

表312周末各组大鼠血常规检测情况（略）

2.5肾组织免疫荧光实验显示模型组中IgA中重度弥漫性地沉积于系膜区，呈散在颗粒状，个别呈团块状，表明造模成功，按荧光分级属于++～+++。正常组、对照组、治疗组大鼠肾组织系膜区IgA无或微弱的沉积。

2.6肾组织光镜HE染色显示正常组肾小球、肾小管、肾间质，未见明显异常。模型组病变主要表现为弥漫的中重度系膜组织增生，也可见部分毛细血管襻受压，管腔狭小及球囊粘连的现象。对照组、治疗组系膜基质增生程度较模型组为轻，系膜细胞数较模型组少。

3讨论

近年来大量资料研究表明，持续蛋白尿是影响IgA肾病预后独立的重要因素。大量蛋白尿致肾小球处于高灌注、高滤过状态，促使肾小球毛细血管发生功能障碍，过多的大分子物质滤过，相继造成系膜细胞损伤，系膜基质增多，渐而导致肾小球硬化，最终使肾功能毁损。同时蛋白尿在肾间质炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞活化或损伤、细胞外基质的降解及肾小管间质损伤等过程中也发挥重要的作用。而且肾小管间质病变将通过肾小球缺血、管一球返馈调节等途径进一步加重肾小球的损害，导致肾功能的减退，最终形成恶性循环，进入肾功能衰竭。因此通过减少蛋白尿，可抑制系膜细胞（MC）增殖，减轻细胞外基质（ECM）积聚，防止肾小球硬化和肾间质纤维化，从而延缓肾脏病变的进程。

中医认为蛋白尿形成的基础是脾肾两虚。脾气虚弱则运化无力，脾阳虚衰则不能升清，精气下注，从溲而泄则出现蛋白尿。肾气虚则精关不固，封藏失职，摄纳无权，精微下注也会导致蛋白尿。再者，脏腑功能失调所致的病理产物与外感六淫之邪可相互为患，迫精外泄而形成蛋白。常见的外邪有风邪、湿邪，病理产物多以湿热、瘀血为患。肾炎2号基本组成为黄芪、制大黄、雷公藤、银花、红花。黄芪具有补气、益卫固表、利水消肿功效。本病主要病机为脾肾气虚，故以黄芪为君药，大补元气治本虚。雷公藤性苦，具有祛风除湿、活血、消炎、解毒之功，以消本病之风、湿外邪，且风又能渗湿，故为臣药。黄芪合雷公藤，增加脾气健运之力，则湿邪不易内困，故能固表而不敛邪，同时祛风渗湿而又不伤正。制大黄、银花、红花为佐药，除本病之标（湿热、瘀血）。制大黄攻下导滞、泻火解毒、祛瘀止血、通淋降浊，银花清热解毒透邪，且黄芪伍银花，亦可鼓舞卫气驱邪；红花通瘀活血为血中气药，制大黄合红花，通久病之络，化久病之瘀。又气能行血，合黄芪更能增加活血化瘀之功。全方益气化瘀、清热渗湿，诸药配伍补而不滞邪，清而不伤正。

本实验结果表明肾炎2号对IgA肾病大鼠模型有以下几个作用。第一：减少蛋白尿。可能通过改善肾小球滤过膜的选择性，恢复肾小球基底膜的电荷屏障作用，减少系膜细胞、系膜基质的合成等途径发挥作用，延缓病情进展。第二：抑制系膜区IgA沉积。沉积在肾小球系膜区的IgA或以IgA为主的免疫球蛋白，可通过活化MC及局部补体系统,启动肾小球炎症过程，促进相关细胞因子、炎症介质产生、导致细胞外基质增多、内皮细胞损伤和GBM结构发生改变等。肾炎2号可能通过抑制系膜区IgA沉积使免疫复合物的形成减少，从而减少了肾小球的进一步损伤。第三：改善IgA肾病病理损伤。中药治疗组与模型组相比系膜基质、系膜细胞的增生明显减少，毛细血管襻开放良好，从病理上提示肾炎2号通过抑制系膜细胞增生和系膜基质增多，减少了肾小球硬化、肾间质纤维化的可能，从而延缓了肾功能的进展。上述实验结果提示本方具有降低尿蛋白、调节免疫、抑制系膜增生等作用。

肾炎2号方中的臣药是雷公藤，本实验结果提示肾炎2号无明显骨髓抑制和肝功能损害的副反应。这可能与方中其它诸药与雷公藤配伍后削弱了雷公藤的毒副作用、人与动物反应的差异性有关。以后的研究中我们将进一步进行肾炎2号的药理及毒理试验，为其临床应用提供更多的可行性、安全性的依据。