三七皂苷R1诱导细胞凋亡中的表达

【摘要】［目的］探讨三七皂苷R1对人白血病细胞株HL?60细胞凋亡作用及其机制。［方法］光镜下观察三七皂苷R1作用下HL?60细胞形态，采用MTT比色法观察三七皂苷R1对人白血病细胞株HL?60细胞增殖的抑制作用。采用流式细胞术检测细胞凋亡改变,并以RT?PCR检测凋亡调节基因survivin、bcl?2mRNA的表达。［结果］三七皂苷R175?1200μg·ml-1可抑制人白血病细胞株HL?60细胞的生长,且呈时间和浓度依赖性。三七皂苷R1作用后人白血病细胞株HL?60细胞呈现凋亡特征，流式细胞术显示凋亡细胞比例升高，凋亡率随作用剂量的增高而升高。RT?PCR检测可见三七皂苷R1150μg/ml作用下survivin、bcl?2mRNA表达减少。［结论］三七皂苷R1能诱导人白血病细胞株HL?60细胞凋亡，其作用可能与凋亡调节基因survivin、bcl?2的下调有关。

细胞凋亡是评估抗肿瘤药物疗效的一个重要指标，中药抗肿瘤机制中的凋亡因素也受到很大重视，三七皂苷R1是中药三七总皂甙的主要成分，有研究认为：三七皂苷R1可抑制HL?60细胞生长，诱导其凋亡，具体机制尚有待深入研究［1］。本研究主要观察三七皂苷R1诱导HL?60细胞凋亡时survivin、Bcl?2基因表达变化并探讨凋亡发生的机制。

1材料与方法

1.1实验材料RPMI?1640培养基为美国Hyclone产品，新生牛血清杭州四季青生物公司，膜联蛋白V（AnnexinⅤ）为PharMingen公司产品，细胞培养瓶和6孔、96孔细胞培养板为Falcon公司产品，二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为AMRESCO产品。三七皂苷R1对照品购自中国生物制品鉴定所，人白血病细胞株HL?60购自上海细胞库。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养：HL?60细胞株悬浮生长于RPMI1640培养液中,内含10%小牛血清,1mmol·L-1谷胺酰胺及青链霉素各100U·L-1。于37℃，5%CO2的饱和湿度孵箱中培养,每2～3d传代1次，于对数生长期细胞做后续实验。

1.2.2细胞形态学观察收集经三七皂苷R1诱导的HL?60细胞，离心洗涤，制细胞薄片，干燥后瑞氏染色，镜下观察细胞核形态变化。

1.2.3MTT比色法检测细胞增殖抑制率：调取HL?60细胞1.0×105/ml,接种于96孔培养板内，每孔100μl,每组各设6个复孔，同时设空白对照孔。加入三七皂苷R1使终浓度分别为75、150、300、600、1200μg·ml-1。分别诱导培养至24h、48h和72h,于终止培养前4h每孔加MTT（5mg/ml）10μl,继续孵育4h。终止培养后，离心，吸去上清,每孔加150μlDMSO（二甲亚砜），摇匀振荡。使结晶充分溶解，于酶联免疫检测仪上测各孔吸光值,波长490nm。根据细胞抑制率=1-（试验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）×100%公式,分别求得各组的细胞存活率。

1.2.4流式细胞仪检测AnnexinⅤ改变收集空白对照组和药物组（三七皂甙R1150、300和600μg·ml-1作用72h）细胞,经预冷的PBS离心洗涤2次后，重悬于100μl的PBS中，加AnnexinⅤFITC标记液5μl，混匀，4℃避光30min，加200μl1×缓冲液，用流式细胞仪（FACScan，BectonDickinson）检测并分析结果。

1.2.5RT?PCR检测survivin、Bcl?2基因mRNA的表达：收集对照组和药物作用组（三七皂苷R1150μg·ml-1作用48h）细胞,TRIzol裂解（GIBCO公司）提取细胞总RNA，特定蛋白分析仪测定RNA纯度（A260/A280>1.75）。加入随机引物及M?MuLV逆转录酶（MBI,FERMENTAS）合成cDNA链。取cDNA0.1μg，加入10×Buffer2.5μl，25mM/LMgCl21μl、10Mm/LdNTP0.5μl，20pmol/μl的上下游引物各0.5μl，TaqDNA聚合酶（Promega,5U/μl）0.5μl，灭菌双蒸水将反应体系补足至25μl。ThermoPX2型PCR仪进行扩增，以β?actin作为内参照。Survivin反应条件为：预变性95℃2min；94℃变性45s，61℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后延伸10min。Bcl?2反应条件为：预变性95℃2min；变性94℃45s,退火67℃45s,延伸72℃1min；最后延伸10min,共35个循环。β?actin反应条件为：预变性95℃2min；变性94℃45s，退火58℃45s，延伸72℃1min；最后延伸10min，共35个循环。各引物序列分别为:survivin上游引物：5′?CTTTCTCAAGGACCACCGCATC?3′;下游引物：5′?CAATCCATGGCAGCCAGC?TGC?3′，目的基因393bp；Bcl?2上游引物为：5’?CAGCGACTTCTCCCGCCGCTACCGC?3’,下游引物为5’?CCGCATGCTGGGGCCGTACA?GTTCC?3’，扩增产物为318bp。β?actin上游引物为：5’?CGCTGCGCTGGTCGTCGACA?3’，下游引物为5’?GTCACGCACGATTTCCCGCT?3’，扩增产物为619bp。扩增产物行1.7％琼脂糖凝胶电泳，于BIO?RADGel2000凝胶成像仪上成像，QuantityOne软件作半定量分析。

2结果

2.1三七皂苷R1对HL?60细胞增殖的影响三七皂苷R1对HL?60细胞的生长抑制与药物浓度有明显的依赖关系，随着药物浓度时间增加,生长抑制率增加,见图1。说明三七皂苷R1抑制HL?60细胞生长有浓度时间依赖性。

图1MTT比色法检测三七皂苷R1对HL?60细胞的增殖抑制（略）

2.2三七皂苷R1诱导HL?60细胞AnnexinⅤ表达：HL?60细胞经150、300、600μg/ml三七皂苷R1诱导72h，流式检测AnnexinⅤ即呈阳性表达，其阳性率为29.95％、42.71％、72.52％；600μg/ml三七皂苷R1作用组阳性率达72.52％,见图2。研究表明，在相同作用时间下，HL?60细胞凋亡率随作用剂量的增高而升高。

图2三七皂甙RI作用HL?60细胞72hAnnexinV分析（略）

（a）空白对照；（b）150μg/ml作用组；（c）300μg/ml作用组；（d）600μg/ml作用组

2.3细胞形态学观察HL?60细胞与300～1200μg·ml-1的三七皂苷共同孵育72h。在光镜下出现典型的调亡形态特征,即细胞体积缩小，胞膜皱缩，核固缩，凝聚，碎裂，并有凋亡小体形成，见图3、4。

图3空白对照组HL?60细胞（略）

图4经三七皂甙R1处理的HL?60细胞（略）

2.4survivin、Bcl?2mRNA表达的变化RT?PCR结果显示,与对照组相比,三七皂苷R1作用48h后，HL?60细胞survivin、Bcl?2基因的mRNA水平下降，见图5、6。

图5HL?60细胞Survivin、β?actinmRNA表达（略）

1为100bpladder；2为空白对照组；3～6为分别为150μg/ml三七皂甙R1诱导HL?60细胞12h、24h、48h和72h的Survivin与P53mRNA表达

图6HL?60细胞Bcl?2mRNA表达（略）

1为100bpladder；2为空白对照组；3～6为分别为150μg/ml三七皂甙R1诱导HL?60细胞12h、24h、48h和72h的Bcl?2mRNA表达3讨论

细胞凋亡是一种主动的,由遗传控制的程序性死亡，对正常细胞影响小，属不可逆死亡，不存在复发和耐药问题［2］；有观点认为，肿瘤细胞可能起源于正常情况下本应该走向凋亡而未发生凋亡的细胞，为了维持整体的高度增殖，肿瘤细胞群会保留抗拒细胞凋亡而存活的细胞，肿瘤细胞的高增殖一方面来自于肿瘤细胞的高增殖能力和低分化程度，另一方面来自于癌细胞的凋亡被抑制、生存延长，这在滤泡型B淋巴瘤中已得到证实［3］。三七皂苷R1为中药三七总皂甙的主要成分之一，石雪迎等报告认为：三七总皂甙有促进MNNG转化的人胃黏膜上皮细胞凋亡的作用［4］；据报导三七皂苷可增加小鼠脾细胞内cAMP含量,从而提高脾细胞杀伤力,增强免疫功能［5］；采用细胞体外培养技术,通过细胞形态学,细胞化学,表面膜抗原的检测,徐罗玲［1］等研究表明三七皂苷R1能诱导HL?60细胞向粒细胞转化；王国俊等研究认为三七皂苷R1可明显抑制HL?60细胞增殖及诱导其凋亡［6］。

我们研究表明三七皂苷R175～1200μg·ml-1,可明显抑制HL?60细胞增殖及诱导其凋亡，并与诱导时间基本呈正相关。MTT法测三七皂苷R1对HL?60细胞的生长抑制率显示75-1200μg·ml-1三七皂苷R1作用48h可显著抑制HL?60细胞增殖,且随着药物浓度及时间增加抑制作用增强,有药物浓度时间依赖性。HL?60细胞经150、300μg/ml、600μg/ml三七皂苷R1诱导72h时，流式检测AnnexinⅤ阳性率为29.95％、42.71％、72.52％，研究表明，在相同作用时间下，HL?60细胞凋亡率随作用剂量的增高而升高。这些结果均表明三七皂苷R1可诱导HL?60细胞凋亡。

survivin是新近发现的一种抗凋亡基因，它定位于17q25,结构独特，分子中不含环指状结构，其表达的蛋白质通过抑制Caspase?3、Caspase?7等途径抑制细胞的程序化死亡［7］，survivin基因在分化组织不表达,在胎组织有表达而在多数肿瘤组织中广泛表达［8］；HL?60细胞株也呈上述表现［9?10］。bcl?2是公认的凋亡抑制基因，通过与bax形成异源二聚体而阻止细胞凋亡［11］。本研究发现,三七皂苷R1作用后的HL?60细胞中survivin、Bcl?2基因的mRNA下降。表明survivin与Bcl?2基因参与三七皂苷R1诱导的HL?60细胞凋亡，并提示三七皂苷R1的凋亡诱导作用可能部分通过survivin、Bcl?2途径实现。